Gerichtete Evolution von Galactoseoxidase

Das pilzliche Enzyme Galactoseoxidase ist ein extrazelluläres Enzym das von verschiedenen Fusarium Stämmen produziert wird. Es besitzt ein außergewöhnliches aktives Zentrum dass aus einem Kupfer Ion und einem Radikal, das von einem Tyrosin gebildet wird dass kovalent an eine Cystein gebunden ist, gebildet wird. Das Enzym katalysiert die Oxidation von primären Alkoholgruppen, z.B. in Galactose, zu den entsprechenden Aldehyden, z.B. Galactose-6-aldehyd, ohne dabei mit anderen reduzierenden Gruppen zu reagieren. Traditionelle organische Chemie benötigt für diese Reaktion hochgiftige Oxidationsmittel wie Chrome-(VI)-salze. Obwohl das Enzym viel unterschiedliche Substrate akzeptiert (von Zuckeralkoholen über aliphatische Alkohole bis zu aromatischen Alkoholen) ist es in Bezug auf Zucker sehr wählerisch und akzeptiert ausschließlich Galactose und nahe verwandte Zucker. Das beeinträchtigt deutlich den möglichen Einsatz der Galactoseoxidase für biotechnologische Anwendungen. Daher ist das Ziel dieses geplanten Antrags die Substratspezifität des Enzyms, besonders in Bezug auf Glucose, zu erweitern. Zwei verschiedene Ansätze werden verfolgt werden. Der erste Ansatz beruht auf der Kristallstruktur der Galactoseoxidase. Interessante Aminosäuren im und in der Nähe des aktiven Zentrums werden mit Hilfe der saturated mutagenesis gegen alle anderen ausgetauscht und die so produzierten Mutanten auf verbesserte Aktivität untersucht. Im zweiten Ansatz wird das gesamte Gen der Galactoseoxidase mit Hilfe von error prone PCR mutiert werden und wiederum die besten Klone mit Hilfe eines einfachen und schnellem membranbasierenden Screeningverfahren ausgewählt. Diese gerichtete Evolution wird mehrmals wiederholt werden. Anschließend werden die besten Klone aus beiden Ansätzen mit Hilfe der genshuffling Technik kombiniert und wiederum die besten der so erhaltenen Klone ausgewählt und detailliert charakterisiert werden. Mit den so erhaltenen Klonen werden Batchumsetzungen mit interessanten Substraten durchgeführt werden und die so erhaltenen Aldehyde werden von unserem italienischen Partner für chemische Synthesen eingesetzt deren. Mit unserem ersten schwedischen Partner werden wir den Einsatz von ausgewählten GalOx Varianten für mediatorlose Biosensoren der dritten Generation testen. Durch die Aufklärung der Kristallstruktur dieser Mutanten durch unseren zweiten schwedischen Partner und dessen Vergleich mit der Struktur des Wildtypenzyms hoffen wir unser Wissen über dieses einmalige Enzym zu erweitern.

Galaktoseoxidase (GalOx) ist ein Enzym das von verschiedenen Pilzen erzeugt wird. Bisher wurden eine Reihe von wichtigen Anwendungen für GalOx beschrieben, unter anderem kann es zum Nachweis von Galaktose in Blut und zum histologischen Nachweis von Krebszellen eingesetzt werden. Für die industrielle Biotechnologie ist dieses Enzym interessant weil es als Biokatalysator für die gezielte Oxidation von Zuckern eingesetzt werden kann. GalOx benötigt dabei nur Sauerstoff für diese Reaktion. Die traditionelle chemische Synthese dieser Komponenten benötigt dagegen den Einsatz von hochgiftigen und krebserregenden Crom (VI) salzen. Ein Beispiel hierfür ist die Umsetzung von Galaktose (ein Bestandteil des Milchzuckers) zu Galaktose-6-aldehyd. Dieser wiederum ist eine interessante Ausgangsverbindung für die Produktion von immunoaktiven Galaktosaminen. In der Lebensmittelindustrie kann es zur Herstellung von Hydrogelen und Emulgatoren verwendet werden. Ein Nachteil dieses Enzyms ist, das es in Bezug auf sein Substrat sehr wählerisch ist und nur Galaktose und wenige nah Verwandte Zucker umsetzt. Das beeinträchtigt deutlich den möglichen Einsatz der GalOx für biotechnologische Anwendungen. Daher war es ein Ziel dieses Projekts die Substratspezifität des Enzyms, besonders in Bezug auf die weitverbreitete Glukose (Traubenzucker), zu erweitern. Dazu wurde das Enzym zuerst aus drei verschiedenen Pilzstämmen isoliert und genauer untersucht. Dann wurden einzelne Aminosäuren die im Reaktionsmechanismus eine wichtige Rolle spielen identifiziert und modifiziert. Die so entstandenen Enzymvarianten wurden auf ihre Eignung zur Anwendung in der Biotechnologie untersucht. Daneben wurde auch ein eng verwandtes Enzym, Glyoxaloxidase, aus zwei Organismen isoliert, produziert und mit der GalOx verglichen. Interessant ist dieses Enzym weil es auf der einen Seite eine sehr ähnliche Struktur wie GalOx besitzt, auf der anderen Seite allerdings eine deutlich unterschiedliche Substrate Spezifität aufweist.