Immuntherapie Papillomavirus-induzierter equiner Tumoren

Es gibt derzeit keine effiziente Therapieform zur Behandlung Papillomavirus (PV)-induzierter humaner und tierischer Tumoren, zu letzteren auch das equine Sarkoid zählt. Immuntherapeutische Strategien zielen zunehmend auf die PV-Onkoproteine E5, E6 und E7 ab, denn präklinische Studien konnten zeigen, welch wichtige Rolle der T-Zellantwort in der Beseitigung PV-induzierter Tumoren zukommt. Chimäre Influenzaviren können, wie am Beispiel von HIV- oder Tuberkuloseepitopen gezeigt, Fremdgene exprimieren und lösen eine manifeste Immunantwort gegen selbige aus. Brandt und andere haben lebend-attenuierte NS1-deletierte Influenzaviren (delNS1) generiert, welche eine ausgeprägte Typ-I IFN-Antwort hervorrufen, die eine Hochregulierung von MHCI und damit die Bildung von T-Helferzellen und einen Anstieg der CTL-Aktivität impliziert. Unser Vorhaben besteht darin, das therapeutische Potenzial delNS1-basierender Vakzine gegen die Onkoproteine E5, E6 und E7 des Sarkoid-induzierenden bovinen Papillomavirus zu untersuchen, indem wir selbige generieren, hinsichtlich ihrer Immunogenität im equinen Modell untersuchen, ihr Antitumorpotenzial in einem Hamstermodell ermitteln und letztlich die so definierten, aussichtsreichsten Kandidaten im natürlich erkrankten Pferd evaluieren.

Papillomvirus-induzierte Tumoren stellen eine häufige Todesursache bei Menschen und Tieren dar. Die persistente Infektion mit humanen hochrisiko-Papillomviren (HPV), v.a. HPV16 und HPV18 verursacht fast alle Zervixkarzinome, die meisten analen und eine Reihe von genitalen und oro-pharyngalen Tumoren. Bovine Papillomviren der Typen 1 und 2 (BPV1, BPV2) und equine Papillomviren des Typs 2 zeichnen für die häufigsten Pferdetumoren, i.e. Sarkoide und genitale Plattenepithelkarzinome, verantwortlich. Die Transformation von normalen zu Tumorzellen erfolgt maßgeblich durch die viralen Onkoproteine E6 und E7. Bislang gibt es keine universell effektive Strategie zur Behandlung Papillomvirus-induzierter Tumorerkrankungen. Ziel dieses Projekts war es, einen Influenza-Virusvektor-basierenden BPV1 Impfstoff-kandidaten herzustellen und hinsichtlich deines therapeutischen Potentials im Pferdemodell zu studieren. Aufgrund technischer Probleme stiegen wir auf ein gut etabliertes Mausmodell um und adaptierten unseren Impfstoff entsprechend. Als Antigen-Vehikel verwendeten wir ein humanes NS1-deletiertes und somit lebend-attenuiertes Influenzavirus, das den Vorteil hat, hoch immunogen und sicher zu sein. Als Ziel-Immunogen stellten wir ein HPV16 E6^E7-Konstrukt (16E6E7-FL) her, das in den delNS1-Locus des Vektors kloniert wurde. Rekombinante Influenzaviren (2 Serotypen) wurden im Anschluss mittels reverse Genetics und Transfektion von Verozellen erhalten. Aus Sicherheitsgründen kam analog auch ein E6^E7-Konstrukt zum Einsatz, das Mutationen enthielt, die die biologische Funktion der beiden Onkogene aufhoben (16E6E7mFL). Korrekte E6^E7 mRNS- und Proteinexpression wurde mittels RT-PCR und Western blot verifiziert. Nach Impfung von C57BL/6-Mäusen mit rekombinantem Impfstoff bzw. Kontrollen wurde die Immunantwort mittels E6-/E7-Peptid-ELISA, IFN-? ELISpot und MLR charakterisiert. Bei geimpften Tieren wurden eine Peptid-spezifische IFN-? Produktion durch Milzzellen und eine Antigen-spezifische CD4+ T-Zellproliferation beobachtet. Auch wurden die rekombinanten Impfstoffe gut vertragen und zeigten keinerlei sichtbare toxische Wirkung. Das prophylaktische und das therapeutische Potenzial der Impfstoffkandidaten wurden in einem murinen Challenge-Modell mittels Einsatz HPV16-transformierter TC-1-Tumorzellen ermittelt. Geimpfte und danach TC-1-inokulierte Mäuse entwickelten entweder keine oder weniger und kleinere Tumoren als Kontrollmäuse. Ähnliche Ergebnisse wurden beim Therapieversuch erzielt, wo Mäuse zunächst mit Tumorzellen inokuliert und danach mit den Impfstoffkandidaten bzw. Kontrollen therapiert wurden. Weiters wurden auch alternative Administrationswege (Intranasal und intratumoral) für die Impfstoffe untersucht. Die intratumorale Applikation führte zur Tumorregression in zwei Fällen. Insgesamt gesehen führte die Immunisierung mit rekombinanten 16E6E7-Viren zu den vielversprechendsten Ergebnissen. Die erhaltenen Daten belegen das tumortherapeutische Potential rekombinanter Influenza-delNS1-basierender Papillomvirusvakzine.