Kritische Targets von Ruthenium-, Platin- und Goldkomplexen

KP1019 ist ein tumorhemmender Rutheniumkomplex, der derzeit in klinischen Studien geprüft wird. Aufrund der vereinfachten Annahme einer Analogie mit Platintherapeutika wurde zunächst die DNA als das kritische Target dieser und einer Reihe weiterer Rutheniumverbindungen angenommen, doch die Gültigkeit dieser Hypothese wurde niemals bewiesen. Auch nicht-klassische Platinverbindungen unterscheiden sich in ihrem DNA-Bindungsverhalten deutlich von Cisplatin, und über die zelluläre Verarbeitung der von diesen Verbindungen geformten Addukte ist wenig bekannt; dennoch wird die DNA trotz des Fehlens klarer experimenteller Beweise als deren kritisches Target betrachtet. Gold(III)-Verbindungen werden gegenwärtig ebenfalls als antineoplastische Wirkstoffe in präklinischen Studien untersucht, aber trotz großer chemischer Ähnlichkeiten zwischen Gold(III) und Platin(II) bleibt die Rolle der DNA als kritisches Target zwerifelhaft. Als Schlüssel zur Klärung dieser Fragen sollen Unterschiede im Vermögen humaner Zellen, metal-induzierte DNA-Schäden zu reparieren, und deren Konsequenzen für die Chemosensitivität dienen. Hierfür sollen von Patienten mit genetischen DNA-Reparatur-Defekten (Xeroderma pigmentosum, Cockayne-Syndrom, Fanconi- Anämie) stammende, transformierte Zellinien herangezogen und mit Tochterlinien, in denen die DNA-Reparatur wiederhergestellt wurde, verglichen werden. Letztere werden, sofern nicht von anderen Quellen beziehbar, durch stabile Transfektion in unserem Labor etabliert. Ergänzend sollen die Auswirkungen von DNA-Reparatur- Inhibitoren in subzytotoxischen Konzentrationen auf die Chemosensitivität gegenüber den Testverbindungen untersucht werden. Einige dieser Metallverbindungen zeigen bekanntermaßen gewisse Interaktionen mit DNA, doch wurden diese bislang weit weniger untersucht als jene klassischer Platintherapeutika. In zellfreien Expermenten sollen daher Veränderungen der elektrophoretischen Mobilität von Plasmiden zeigen, ob die Verbindungen Veränderungen der DNA-Sekundärstruktur bewirken. Weiters sollen, unabhängig von der Bedeutung als kritisches Target, das Ausmaß der DNA-Bindung sowie die Induktion von Quervernetzungen oder Strangbrüchen in humanen Krebszellen mittels ICP-MS-Quantifizierung und Comet Assay untersucht werden. In der jüngsten Zeit wird zunehmend das Thioredoxin/Thioredoxinreduktase(Trx/TrxR)-System, ein wichtiger zellulärer Schutz gegen oxidativen Stress, als alternatives molekulares Target und/oder Determinante der Chemosensitivität gegenüber Gold- und Platinverbindungen diskutiert. Es erscheint daher angemessen, den Einfluß der TrxR-Expression und -Aktivität in humanen Krebszellen auf deren Chemosensitivität gegenüber den Testverbindungen zu untersuchen. Zu diesem Zweck soll eine TrxR-Überexpression in Zellen durch stabile Transfektion mit geeigneten Vektoren induziert werden. Zusätzlich soll die Bindung der Verbindungen an TrxR mittels elektrophoretischer und massenspektrometrischer Techniken charakterisiert werden.

Neuartige Metallverbindungen, die derzeit als Wirkstoffe für die Krebs-Therapie entwickelt werden, sind in der Lage, mit DNA zu interagieren, und gemeinhin wurde in Analogie zu Cisplatin angenommen, dass DNA-Addukte für deren Aktivität verantwortlich sind, obwohl klare experimentelle Belege hierfür fehlen. Um die Relevanz dieser DNA-Addukte zu beurteilen, wurde intensiv an der Etablierung verschiedenster Zell-Modelle mit definierten Unterschieden in der Funktionstüchtigkeit der DNA-Reparatur-Systeme NER, BER und ICLR gearbeitet. Bemerkenswerterweise erwies sich dabei ein transienter siRNA-basierter Knock-down von NER- und BER-relevanten Genen mit erheblicher Effizienz (sogar bei Anwendung auf zwei Reparaturfaktoren gleichzeitig) als unzureichend für eine Sensitivierung von Krebszellen gegenüber Cisplatin oder Thiotepa, deren antitumorale Wirkung nach allgemeiner Auffassung auf DNA-Addukten beruht, die Substrate für die NER bzw. BER darstellen. An effizienteren Knock-downs wird weiter gearbeitet.DNA-Interaktionen von trans-Platin-Komplexen mit Oxim-Liganden wurden charakterisiert, wobei ein für Platinverbindungen noch nicht gekanntes Ausmaß an Genotoxizität (DNA-Strangbrüche) festgestellt wurde und (im Gegensatz zu Cisplatin) keine Anzeichen für DNA-Quervernetzungen, was die Beurteilung dieser Verbindungsklasse grundlegend verändert hat. In vivo wurden keine Anzeichen therapeutischer Wirksamkeit in tolerabler Dosierung beobachtet; die biologischen Effekte erscheinen somit als therapeutisch wahrscheinlich ungeeignet. Nahe verwandte Komplexe mit Guanidin-Liganden zeigten im Durchschnitt stärkere Effekte auf die DNA-Sekundärstruktur in vitro, sogar dann, wenn der Komplex keine wahrscheinliche Abgangsgruppe enthielt. In vivo-Befunde stehen hierzu noch aus.In einem komplementären Ansatz gelang es mittels hochauflösender Sekundärionen-Massenspektrometrie (NanoSIMS), die Verteilung von Cisplatin in menschlichen Krebszellen detailliert darzustellen. Dabei wurde in cisplatin-behandelten Zellen eine Anreicherung von Platin im Chromatin und v. a. in den Nucleoli festgestellt. Die Anreicherung im Bereich des Chromatins steht im Einklang mit DNA als molekularem Target von Cisplatin, über die gesamte Zelle betrachtet ist Platin jedoch stärker mit Schwefel als mit Phosphor assoziiert. Insbesondere im Zytoplasma finden sich zahlreiche Platin-Hotspots, die durchwegs schwefelreich sind und mittels konfokaler Fluoreszenz-Mikroskopie als saure Vesikel (wahrscheinlich v. a. Lysosomen) identifiziert wurden. Bei Verwendung von Cisplatin mit 15N-markierten Ammin-Liganden legten die NanoSIMS-Analysen eine Verringerung des Mengenverhältnisses von 15N zu Platin insbesondere in den Nucleoli nahe, was auf einen teilweisen Verlust der (vermeintlich stabil gebundenen) Ammin-Liganden hindeutet.