Einzelzellanalyse der MazF-abhängigen Stressantwort

Bacteria adapt to adverse environmental conditions by altering gene expression patterns. Recently, a novel stress adaptation mechanism has been described that allows Escherichia coli to alter gene expression at the post-transcriptional level. The endoribonuclease MazF (the toxin component of the toxin-antitoxin module MazEF) is one of the key players responsible for the stress-induced production of leaderless mRNAs, which lack the ribosome binding site. MazF concomitantly modifies the ribosomes, making them selective for the translation of leaderless mRNAs. Intriguingly, the activation of MazF and other toxin- antitoxin systems has been implicated in the persistence phenotype in E. coli. Persistence is a prime example of phenotypic heterogeneity that arises in populations of genetically identical cells independently of genetic or environmental differences. Persister cells represent only a minor fraction of a clonal population that grows much slower than the majority of cells and can endure antibiotic treatments. However, the function of MazF in bacterial cells that persist antibiotic treatment or nutrient starvation still remains elusive. Thus, my main interest is to study the MazF-mediated post-transcriptional stress response from the single-cell perspective. Since only a small fraction of a bacterial population is able to express the persistence phenotype, I will address the question whether all cells or only a fraction of cells within a clonal population induce MazF under antibiotic stress or nutrient starvation. I hypothesize that the potential heterogeneous production and translation of leaderless mRNAs provide benefits for bacterial populations. Consequently, the cells with active MazF would selectively survive stress and thereby represent the subpopulation that will resume growth after the stress is removed. To tackle these questions, I will use flow cytometry combined with biochemical techniques as well as fluorescence time- lapse microscopy and microfluidics. This research project is anticipated to assess the physiological importance of the newly discovered MazF-dependent stress adaptation mechanism in single bacterial cells with respect to survival of the population. Hence, the expected results will provide novel insights into the molecular basis of phenotypic heterogeneity in the bacterial stress response and will contribute to a better understanding how bacterial populations endure antibiotic treatments and starvation upon host infection. Collectively, this is an important step towards development of strategies for the eradication of persister cells, which is currently one of the most challenging problems in medical microbiology.

Bakterien sind in ihrer natürlichen Umgebung verschiedensten Stressbedingungen ausgesetzt, wie zum Beispiel Nährstoffmangel, Hunger oder Antibiotika. Um sich schnell und effizient an Umweltveränderungen anzupassen haben Bakterien verschiedene Schutzprogramme entwickelt, welche die bakterielle Stressantwort genannt werden. Hier untersuchten wir einen Mechanismus, der Bakterien hilft Stress zu bewältigen. Dieser Mechanismus beruht auf der Aktivierung von Toxin-Antitoxin-Systemen, welche eines der Markenzeichen der bakteriellen Toleranz gegen Antibiotika sind, und wir waren besonders an einem Toxin, MazF, interessiert. MazF wird ein "Toxin" genannt, weil seine Aktivität für Bakterien schädlich sein kann: MazF baut zelluläre RNA ab, und diese Aktivität verlangsamt somit das Wachstum von Bakterien. Jedoch kann MazF auch RNA prozessieren und somit zur Modulation von Genexpression beitragen. Interessanterweise wurde die Aktivierung von MazF und anderer Toxin-Antitoxin-Systeme mit dem Persistenz Phänotyp im Modell-Bakterium Escherichia coli und wichtiger noch in verschiedenen pathogenen Bakterienspezies in Zusammenhang gebracht. Nur ein kleiner Prozentsatz der Bakterienzellen in einer klonalen Population können Antibiotika-Behandlungen tolerieren, und diese Zellen werden Persister-Zellen genannt.In diesem Projekt haben wir erforscht ob sich unter Stressbedingungen genetisch identische Bakterienzellen in der Expression und Aktivierung des MazF Toxins unterscheiden, und wie viel von dieser Variation auf die betroffenen zellulären Prozessen, also Wachstum und Genexpression, übertragen wird. Unsere Ergebnisse zeigen eine hohe Schwankung der MazF Aktivität; in anderen Worten, einige Zellen produzieren und aktivieren mehr MazF als andere. Diese Variation manifestiert sich auf zwei Ebenen. Erstens, während der MazF-Induktion unterscheiden sich Bakterienzellen in ihrer Wachstumsgeschwindigkeit, so dass, obwohl das Bakterienwachstum im Durchschnitt reduziert ist, einige Zellen schneller wachsen als andere. Wir zeigen auch, dass diese Heterogenität in der Wachstumsgeschwindigkeit eine Folge der komplexen Mechanismen ist welche die Konzentration des MazF Toxin regulieren. Somit ermöglicht die komplexe Regulation der mazF Expression den Zellen MazF-vermittelten Stress schnell anzuschalten, aber auch schnellstmöglich abzuschalten, und erlaubt somit den Zellen das Wachstum wieder aufzunehmen sobald der Stressor entfernt ist. Zweitens, unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass bakterielle Populationen in stressigen, MazF-aktivierenden Bedingungen und nach Entfernung des Stressors und Wiederaufnahme des Wachstums ein beträchtliches Maß an schwankender Genexpression aufweisen können. Die in diesem Projekt gewonnenen Resultate liefern neue Einblicke in die molekularen Grundlagen der phänotypischen Variation in der bakteriellen Stressantwort, und tragen zu einem besseren Verständnis bei, wie Bakterienpopulationen Antibiotika-Behandlungen und Hungerzustände wären der Infektion eines Wirtes ertragen. Dies ist ein wichtiger Schritt zur Entwicklung von Techniken um sogenannte Persister-Zellen zu bekämpfen welche derzeit eine der größten Probleme in der medizinischen Mikrobiologie darstellen. Zusammenfasst, das Wissen über die physiologische Rolle verschiedener Toxin-Antitoxin Systeme und deren Einfluss auf zellulären Prozesse könnte die Entwicklung neuer antimikrobieller Strategien ermöglichen