Paraspeckles: nukleare Körper basierend auf NEAT1 Struktur

Ribonukleinsäuren (RNS) sind während jedem Schritt der Genexpression essentielle Katalysatoren und Regulatoren. Viele neue Gruppen von nicht-kodierenden RNS sind in den letzten Jahren beschrieben worden. Besonders lange nicht-kodierende Ribonukleinsäuren (Englisch: lncRNAs) zeigen eine Vielzahl von variierenden Funktionen, angefangen bei der Gerüstbildung biszurSignalweiterleitung. LncRNAswurdenmit verschiedenen Krankheitspathologien in höheren Eukaryoten in Verbindung gebracht, welche auf einzelnen Nukleotidpolymorphismen basieren, die wahrscheinlich Einfluss auf die Konformation der RNSund/oder ihrerWechselwirkungenmit Proteinpartnern haben. Trotz ihrer biomedizinischen Bedeutung, ist die Struktur von lncRNAs und ihre Auswirkung auf die Funktion bislang größtenteils noch unbekannt. NEAT1 ist eine lncRNA, die als Gerüst für spezielle Zellkompartimente, sogenannte Paraspeckles, dient. Paraspeckles sind an der zellulären Stressantwort und Zelldifferenzierung beteiligt. Das Paraspeckle selbst ist eine dynamische Struktur, die nach jedem Zellzyklus neu aufgebaut wird und deren Größe sowie Anzahl während der Stressreaktion zunimmt. Paraspeckles enthalten eine spezielle RNS- bindende Proteinfamilie, die Drosophila behavior/human splicing (DBHS) Proteine, die für die Biogenese von Paraspeckles sowie deren Aufrechterhaltung notwendig sind. Interessanterweise findet die Biogenese von Paraspeckles co-transkriptionell am NEAT1 Genlokus statt und benötigt zwei der DBHS Proteine. Die Wechselwirkungen innerhalb der RNS sowie zwischen der RNS und Proteinen in Paraspeckles ist kaum untersucht und basiert ausschließlich auf Immunopräzipitationsexperimenten. Um die molekulare Architektur von Paraspeckles zu verstehen, werde ich die Faltung des kurzen NEAT1 Transkripts, welches für die Bildung von Paraspeckles wichtig ist, mit chemical probing ermitteln. Dieses Projekt wird Aufschluss über die erste in vivo Faltung einer lncRNA liefern. Zudem beabsichtige ich mögliche Konformationsänderungen innerhalb der kurzen NEAT1 RNS hervorgerufen durch das Paraspeckleprotein NONO zu entschlüsseln. Diese Veränderungen wären entweder das Ergebnis von direkten RNS-Protein Kontakten oder neuartige intramolekulare Wechselwirkungen der NEAT1 RNS, welche sich nur in Gegenwart von NONO ausbilden können. Ich werde des Weiteren untersuchen, welche der Paraspeckle Proteine NEAT1 direkt binden und wo diese Wechselwirkungen stattfinden, unter Verwendungvon high-throughputsequencing togetherwithUV-crosslinkingand immunoprecipitation (HITS-CLIP). Zusammen mit der in vivo Struktur der kurzen NEAT1 RNS werden diese Daten Aufschluss über die molekulare Architektur von Paraspeckles geben. Insgesamt werden die durch dieses Projekt gewonnen Daten einen ersten Einblick geben, wie eine Gerüst-lncRNA gefaltet ist und wie die Interaktionen mit ihren Proteinbindungspartnern die Architektur eines nuklearen Kompartiments gestalten.

Wissenschaftlicher Hintergrund: Ribonukleinsäuren (RNS) sind während jedem Schritt der Genexpression essentielle Katalysatoren und Regulatoren. Viele neue Gruppen von nicht- kodierenden RNS sind in den letzten Jahren beschrieben worden. Besonders lange nicht- kodierende Ribonukleinsäuren (Englisch: lncRNAs) zeigen eine Vielzahl von variierenden Funktionen, von der Gerüstbildung bis hin zur Signalweiterleitung. LncRNAs wurden mit verschiedenen Krankheitspathologien in höheren Eukaryoten in Verbindung gebracht, welche auf einzelnen Nukleotidpolymorphismen basieren, die wahrscheinlich Einfluss auf die Struktur der RNS und/oder ihrer Wechselwirkungen mit Proteinpartnern haben. Trotz ihrer biomedizinischen Bedeutung, ist die Struktur von lncRNAs und ihre Auswirkung auf deren Funktion größtenteils unbekannt. Projektfokus: NEAT1 ist eine lncRNA, die als Gerüst für spezielle Zellkernkompartimente, sogenannte Paraspeckles, dient. Paraspeckles sind unter anderem an der zellulären Stressantwort und Zelldifferenzierung beteiligt. Das Paraspeckle selbst ist eine dynamische Struktur, die nach jedem Zellzyklus neu aufgebaut wird und deren Größe sowie Anzahl während zellulären Stressreaktionen zunimmt. Paraspeckles enthalten eine spezielle RNS- bindende Proteinfamilie, die Drosophila behavior/human splicing (DBHS) Proteine, welche für die Biogenese von Paraspeckles sowie deren Aufrechterhaltung notwendig sind. Projekt Zielsetzung: Zu verstehen, wie die kurze NEAT1 RNS sich in vivo faltet und wie ihre Interaktion mit Proteinbindungspartnern die Architektur eines nuklearen Kompartiments gestaltet. Insbesondere die Interaktion mit dem Paraspeckle Protein NONO war ausschlaggebend, weil dieses essentiell in der Biogenese von Paraspecklen ist. Da es zwei transkribierte RNS Varianten vom NEAT1 Gen gibt, die kurze und die lange, war es umso wichtiger zu verstehen, wie die kurze NEAT1 RNS in der molekularen Architektur des Paraspeckles mitwirkt. Projektresultate: Die Hypothese zu Beginn, dass die kurze NEAT1 RNS wichtig für Paraspeckle Biogenese oder deren Erhalt ist, hat sich als falsch erwiesen. In Experimenten von Li et al. (2017) wurde gezeigt, dass es in Zellen, die nur die kurze NEAT1 RNS exprimieren, keine Paraspeckles mehr gab. Die kurze NEAT1 RNS bildete zwar zahlreiche Microspeckles, in diesen war aber das Paraspeckle Protein NONO nicht vorhanden. Folglich ist die kurze NEAT1 RNS nicht beteiligt am Aufbau von Paraspeckles. Die in vivo Faltung der kurzen NEAT1 RNS hat sich als technisch noch nicht umsetzbar erwiesen. Daher wurde die in vitro Faltung von NEAT1 RNS in Angriff genommen, jedoch publizierte Lin et al. (2018) zuvor. Ihre Daten zur in vitro Faltung der kurzen NEAT1 RNS zeigen ebenso eine komplette Rückfaltung der beiden RNS Enden sowie die Ausbildung von 4 Domänen. Sie bestätigen somit unsere in silico Faltung der kurzen NEAT1 RNS mithilfe der RNAfold Software (ViennaRNA Package).