Neue antifungale Strategien: Struktur und Funktion von NFAP

The increased incidence of severe fungal infections and the fast development of drug resistant filamentous fungi causing mycoses, plant infections or damage of cultural heritages strongly demand for the development of new antifungal strategies. Small, cysteine-rich, highly stable antifungal proteins secreted by filamentous Ascomycetes have great potential for application in these fields. The antifungal protein NFAP from the Neosartorya fischeri NRRL 181 isolate is a novel representative of this protein group. In our previous work we demonstrated that NFAP effectively inhibits the growth of numerous filamentous Ascomycetes including potential human and plant pathogens, and its antifungal effect is dose-dependent and strongly influenced by the extracellular mono- and divalent cation concentration. In susceptible fungi, NFAP causes damage to the cell wall by destructing chitin filaments and triggers apoptotic-necrotic pathways by intracellular accumulation of reactive oxygen species. However, we could also show that NFAP differs in its antifungal spectrum, its antifungal mode of action and its tertiary structure from the two most investigated NFAP-related proteins, the Aspergillus giganteus antifungal protein AFP and the Penicillium chrysogenum antifungal protein PAF. Further efforts are needed to characterize in detail the solution structure of NFAP, its structure-function relation, the primary targets and the antifungal mode of action, which have not been investigated in detail so far. The proposed project aims to clarify two aspects: (1) the connection between the protein structure and the antifungal properties; and (2) the identification of target molecules of NFAP. We will address the first question by investigating the role of structural features of NFAP by nuclear magnetic resonance, thermal unfolding experiments and antimicrobial susceptibility tests. To this end distinct recombinant NFAP protein mutants will be generated for structure-function investigations. The second question we will address by molecular screening of (i) potential lipid targets of NFAP via in vitro protein-lipid overlay assays and (ii) protein receptors by chemical cross-linking, affinity purification, and differential mass spectrometry. The results will significantly contribute to the understanding of the mode of action and structure-function relation not only of NFAP but also of other cysteine-rich antifungal proteins from Ascomycetes in general. Taking into account the wide distribution of antimicrobial proteins in nature, our project will help to solve problems that are also relevant for related antimicrobial proteins. A detailed insight into the structure, function, interaction with target molecules and antifungal mechanisms of more members of this new protein group is an essential prerequisite for the identification of protein motifs with specific functions. This ultimately enables the construction of synthetic or chimeric proteins with improved and specific antimicrobial potential for medical therapy, pest control, food preservation and conservation of cultural heritages in the near future and the outcome of our project promises patent registration.

Es besteht großer Bedarf neue Strategien zur Behandlung von Infektionen zu entwickeln, die durch human- und pflanzenpathogene Pilze hervorgerufen werden, oder die den Pilzbefall unserer Kulturgüter und Gebäude Einhalt gebietet. Besonders im medizinischen Bereich wird mit großer Sorge die Zunahme von lebensbedrohlichen Infektionen durch Schimmelpilze und das Auftreten von Therapie-resistenten Stämmen beobachtet. Das kleine, Cystein-reiche und kationische Protein NFAP aus dem Schimmelpilz Neosartorya fischeri (Klasse Ascomyceten) hemmt das Wachstum zahlreicher human- und pflanzenpathogener Schimmelpilze und ist sehr stabil. Aufgrund dieser Eigenschaften ist NFAP besonders geeignet, als Konservierungsmittel, Bio-Pestizid und Anti-Mykotikum eingesetzt zu werden. Derzeit ist wenig über seine Struktur, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion und mögliche Rezeptormoleküle in sensitiven Schimmelpilzen bekannt, obwohl diese Kenntnisse wichtig wären, um die Effizienz von NFAP durch rationales Wirkstoffdesign verbessern zu können. Um die genannten Aspekte zu untersuchen, entwickelten wir im Zuge dieses Projekts ein neues Expressionssystem zur kosteneffizienten Produktion von großen Mengen an NFAP und anderen Cystein-reichen antifungalen Proteinen für ihre strukturelle und funktionelle Charakterisierung. Als Expressionsorganismus diente der von der US Behörde "Food and Drug Administration" als "sicher" eingestufte Schimmelpilz Penicillium chrysogenum. Dieses Expressionssystem könnte problemlos von der biotechnologischen Industrie adaptiert werden. Mit Hilfe dieses Systems konnte NFAP in ausreichenden Mengen und in bester Qualität für seine Strukturanalyse gewonnen werden. Darüber hinaus konnten wir Strukturmotive identifizieren, die essentiell für die richtige Faltung, die kompakte Struktur und daraus folgend für die antifungale Aktivität von NFAP sind. Darauf basierend rückt ein zukünftiges rationales Wirkstoffdesign in greifbare Nähe. Studien zur Wirkungsweise von NFAP wiesen auf eine mögliche Mitochondrien-schädigende Wirkung in sensitiven Pilzen hin, was als potentielle Zielstrukturen für neuartige Therapiemöglichkeiten weiter erforscht werden sollte. Als ein weiterer Meilenstein in der Charakterisierung von zukunftsweisenden antifungalen Molekülen ist die Identifizierung des neuen, Cystein-reichen Proteins NFAP2 aus N. fischeri, das starke wachstumshemmende Aktivität auf die klinisch-relevante und humanpathogene Hefe Candida albicans aufweist. NFAP2 wäre deshalb bestens geeignet, um neue Strategien zur Behandlung von Candida-Infektionen zu entwickeln. Somit sind die gewonnenen Erkenntnisse über die strukturellen und funktionellen Zusammenhänge, die NFAP betreffen, auch besonders wertvoll für eine entsprechende Analyse von NFAP2. Unsere Ergebnisse tragen daher in bedeutender Weise zum Verständnis der Struktur und Funktionsweise von NFAP-verwandten und strukturell ähnlichen Cystein-reichen, kationischen Proteinen mit antifungalem Potenzial bei und ebnen den Weg für die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung von Pilzinfektionen.