FunktionelleAnalyse von Histon in männlichen Pflanzengameten

Histone sind eine Hauptkomponente des Chromatins, die DNA binden, um eine dichte Chromatinpackung im Zellkern zu ermöglichen und die Regulation von Genen zu ermöglichen. Eukaryotische Abstammungslinien haben gemeinsame Histonsequenzvarianten und erlauben Vielfalt in Chromatinstruktur, die zellularer Spezifizierung und epigentischer Vererbung erlauben. Während der Spermatogenese durchlaufen Tiere und Pflanzen eine dramatische strukturelle Organisation des Genoms, welches dazu dient, das väterliche Chromatin als Vorbereitung für den Transfer zu den weiblichen Gameten dicht zu packen und zu schützen. Studien in der Maus, haben gezeigt, dass Testes-spezifische Histonvarianten spezifische Loci markieren, um die Re-organisierung des Genoms zu unterstützen und Gene für ihre Expression während der Embryogenese vorzubereiten. Seit fast 20 Jahren sind Spermazellen-spezifische Histonvarianten in Pflanzen bekannt, jedoch weiß man immer noch Wenig über ihre Rolle in der Re-programmierung des väterlichen Genoms. Männliche Keimzellen in Arabidopsis sind durch die Expression zweier spezifischer Histonvarianten charakterisiert, HTB8 und HTR10, welche jeweils H2B.8 und H3.10. Histone codieren. Frühere Expressionsanalysen von Fred Bergers Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass H2B.8 und H3.10 auch im verdichteten Chromatin des Zellkerns von Kotyledonenembryos während der Embryogenese angereichert sind, was einen Hinweis auf ihre potentielle Rolle für die Verdichtung von Chromatin liefert. Somit repräsentieren H2B.8 und H3.10 eine passende Fallstudie zur Erforschung der epigenetischen Rolle spezifischer Histonvarianten in der Gametogenese und späten Embryogenese von Pflanzen, und liefert Einblick darin, wie Chromatinarchitektur und Differenzierung verknüpft sind. Dieser Antrag beschreibt ein 24-monatiges Projekt, konzipiert zur funktionellen Charakterisierung von H2B.8 und H3.10 unter Verwendung eines vergleichenden Ansatzes, welcher sowohl Pollen- als auch Samenchromatin in Arabdiospsis thaliana beinhaltet. Zusätzlich wird die Ontologie der Pollen als zelluläres System genutzt, um räumliche und zeitliche Veränderungen im Chromatingehalt während der Pollenentwicklung zu studieren. Um die in diesem Antrag beschriebene Gesamtzielstellung zu erreichen, wurde die Methodik so konzipiert, dass die fünf Hauptschwerpunkte durchgeführt werden können: (1) die genomweite Kartographierung von H2B.8- und H3.10-Ablagerungen mittels ChIP-Seq von nativen und GFP Antikorpern, (2) verwenden erweiterte Mikroskopie und profilierung das Transkriptom in Mutationslinien zur Untersuchung des Einflusses von H2B.8 und H3.10 auf der Genexpression und Chromatin Kondensation (3) Aufzeichnung des Post- translationmodifikationszustandes von H2B.8 und H3.10 in planta mittels Massenspektrometrie, (4) Vergleich von Histonkompliment und Modifikationszustand im Zellkern von Keimvorzellen und generativen und vegetativen Pollenzellen mittels quantitativer Massenspektrometrie, (5) Identifizierung von H2B.8- und H3.10-Orthologen in Landpflanzen und Nachweis konservierter Spezifität in männlichen Gameten mittels in situ Hybridisierung. Es ist geplant, das Projekt in Dr. Frederic Bergers Arbeitsgruppe am Gregor Mendel Institut in Wien durchzuführen.

Komplexe mehrzellige Organismen bestehen aus verschiedenen Zelltypen, die unterschiedliche Gewebe und Organe bilden. Eine fundamentale Frage der Biologie ist, wie in einem Organismus unterschiedliche Zelltypen entstehen können, obwohl alle Zellen dieselbe DNA aufweisen. Die Genregulation spielt in diesem Prozess eine bedeutende Rolle. Sie bestimmt in den verschiedenen Zelltypen die Aktivierung unterschiedlicher Gene zu ganz bestimmten vorgegebenen Zeitpunkten. Die Genexpression wird hauptsächlich durch eine dynamische Struktur, dem Chromatin gesteuert ein DNA-Komplex, der um spezielle Proteine, die sog. Histone, gewickelt ist. Diese Histone sind die Angriffspunkte verschiedener chemischer Abläufe. Diese chemischen Abläufe bestimmen, ob ein Chromatinstatus eines Gens aktiv geschaltet oder stillgelegt wird. Unterschiedliche Arten von Histonproteinen sind in komplexen Organismen weit verbreitet. Sie verursachen die Vielfältigkeit der Chromatinstruktur und beeinflussen dadurch sowohl die Genexpression als auch das platzsparende Verpacken der DNA in den Zellkernen. Blütenpflanzen sind die auf der Erde am häufigsten vorkommenden Pflanzen. Sie produzieren Samen, Körner und Früchte und stellen damit einen großen Bestandteil der menschlichen Ernährung dar. Der Schlüssel zum evolutionären Erfolg der Blütenpflanzen war die innovative Bildung des Pollenkorns. Dieses besteht aus zwei Spermienzellen, die in einer großen vegetativen Zelle eingebettet sind. Aufgrund seiner einfachen dreizelligen Struktur ist der Pollen sehr gut geeignet zur Erforschung der molekularen Grundlagen der Genregulation, und wie diese Genregulation dann die Entstehung unterschiedlicher Zelltypen bewirkt. Das Chromatin im Pollenkorn erlebt während dessen Entwicklung eine dramatische strukturelle Reorganisation. Die vegetative Zelle und die Spermienzellen weisen einen sehr unterschiedlichen Chromatinstatus auf, was im Mikroskop sofort ins Auge sticht. Seit fast 20 Jahren weiß man bereits, dass das Pollenchromatin eine spezielle Art von Histonen enthält. Jedoch ist es bis jetzt völlig unbekannt, wie diese Histone im Pollen die Chromatinorganisation beeinflussen. In diesem Projekt haben wir die molekulare Basis der unterschiedlichen Chromatinstrukturen der verschiedenen Pollenzellen (Spermienzellen/vegetative Zelle) untersucht sowie die Funktion der pollenspezifischen Histone. Durch dieses FWF Lise Meitner Fellowship Projekt von Dr. Michael Borg und Dr. Frederic Berger, Forscher am Gregor Mendel Institut der Österreichischen Akademie der Wissenschaften konnte nachgewiesen werden, dass ein bei Blütenpflanzen weit verbreitetes spermienspezifisches Histon eine bedeutende Rolle in der Reorganisation des Zellchromatins der Spermienzellen spielt. Durch seine Modifikation wird eine Aktivierung spermien-spezifischer Gene ausgelöst. Mit Hilfe einer speziellen Technik, der sog. ATAC-seq., konnten die Forscher untersuchen, welche Teile des Chromatins offen sind, und sie konnten dadurch die aktiven Teile des Genoms anzeigen. Ihre Arbeit zeigt, wie durch die unterschiedlich geöffneten Chromatinzustände der Pollenzellen ein einzigartiges Set verschiedener Gene aktiviert wird, welches die Funktion und Fruchtbarkeit des Pollens sicherstellt. Diese neuen Erkenntnisse können in der Landwirtschaft zur verbesserten nachhaltige Sicherstellung landwirtschaftlicher Ernten beitragen. Auf der anderen Seite liefern die Erkenntnisse dieses Forschungsprojekts grundlegende neue Erkenntnisse darüber, wie der Chromatinstatus Einfluss auf die Genexpression und damit auf die Zelltypen komplexer mehrzelliger Organismen ausübt.