Zum Reaktionsmechanismus von Legumain auf atomarer Ebene

Das Enzym Legumain katalysiert die Protein-Spaltung und -Abbau im Substrat unter stark sauren Bedingungen. Da die Umgebung von vielen Tumoren sauer ist, kann hier eine solche Aktivität auftreten. So ist eine gezielte Verwendung von Legumain für die experimentelle Pro-Drug Aktivierung von Chemotherapeutika in Tumorzellen vorstellbar. Laut dem allgemein akzeptierten Mechanismus verläuft die katalytische Reaktion in zwei Schritten, der genaue Mechanismus wurde jedoch bisher noch nicht aufgeklärt. Das Ziel dieses Projekts ist es, mit Hilfe von computerunterstützten Molekülmodellierungsverfahren den Reaktionsmechanismus von Legumain auf atomarer Ebene zu studieren. Dabei wird das Softwarepaket NWChem verwendet. Ausgehend von der Röntgenstruktur des Enzym-Substrat Komplexes (LegumainCystatin) wird sowohl die Acylierung als auch die Deacylierung Schritt-für-Schritt untersucht. Dazu setzen wir harmonische Federn ein, um die entsprechende Bindung zu brechen oder zu erzeugen. Durch diese Methode können die erwünschten Intermediate und Produktzustände modelliert werden. Anschließend lassen sich die Übergangsstrukturen identifizieren und die freie Energie wird berechnet, um schließlich den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt und die Reaktionsbarriere des katalytischen Zyklus zu bestimmen. Darüber hinaus sollen die Ergebnisse der Mutagenese Studien und die pH-Abhängigkeit erklärt werden. Im Rahmen des Projekts analysieren wir mehrere alternative Reaktionswege sowie verschiedene Protonen-Transferwege und vergleichen die berechneten Reaktionsenergien mit den experimentell gemessenen Werten. Aufgrund der zentralen Funktion der biologischen Aktivität von Legumain in der Krebstherapie ist das grundlegende Verständnis des gesamten katalytischen Mechanismus unentbehrlich, um effektive Pro-Drug aktivierte Chemotherapeutika entwickeln zu können.

Abhängig von der pH-Wert der Umgebung die Cystein-Protease Legumain katalysiert die Protein-Spaltung (pH 4.0) und/oder Ligation (pH 6.0) bevorzugt hinter Asparagin und in manchen Fällen hinter Asparaginsäure. Im Laufe des Projekts könnten wir, mit Hilfe von quantenchemischen Methoden die pH-abhängige duale Funktion von menschlichen Legumain aufklären. Ausgehend aus der Röntgenstruktur des LegumainCystatin Komplexes konnten wir zeigen, dass der Protonierungszustand der Aminosäuren (Cys189 und His148) in dem aktiven Zentrum des Enzyms sowohl für die Spaltung als auch für die Ligation eine entscheidende Rolle spielt. Folgende wichtige Meilensteine sind für den berechneten Reaktions-mechanismus erreicht worden:Die Spaltung beginnt mit protonierten Cys189 und neutralen His148Das Proton von Cys189 wandert zu dem Stickstoff der spaltenden PeptidbindungEs gibt keine Papain-ähnliche klassische tetraedrische Zwischenstufe, die erste stabile Zwischenstufe ist das Acyl-EnzymDer Wasserangriff an dem Thioester ergibt ein Diol (zweite stabile Zwischenstufe), wobei das Nukleophil ist das OHHis148 dient als Base für das Diol während des letzten Schritts des Reaktionsmechanismus, Bildung des Produktzustands.Die Ligation kann in einem Schritt ohne Cys189 Teilnahme erfolgen. Dieses überraschende Ergebnis wurde experimentell und durch Berechnungen mit C189M mutierten Enzym und mit MMTS blockierten Cys189 unterstützt.Nur deprotoniertes Cys189 kann als Ligase funktionieren, dieses stimmt mit dem pH-Profil des Enzyms übereinSolange das katalytische Wasser im aktiven Zentrum vorhanden ist, ist die genaue Rückwertsreaktion der Spaltung nicht möglich, weil der Schwefel des Thioesters ist als Base nicht stark genug im den N-terminalen Stickstoff zu deprotonieren. Transpeptidierung über das Thioester kann stattfinden, sobald das katalytische Wasser das aktive Zentrum verlässt. Darüber hinaus das ist das erste Mal, dass die kompletten Reaktionswege beider enzymatischen Aktivitäten aufgeklärt werden und stimmen mit experimentellen Daten exzellent überein. Aufgrund der zentralen Funktion der biologischen Aktivität von Legumain in der Krebstherapie ist das grundlegende Verständnis des gesamten katalytischen Mechanismus unentbehrlich, um effektive Pro-Drug aktivierte Chemotherapeutika entwickeln zu können.