nDimensionale Spin Relaxation zur Untersuchung von IDPs

Lange Zeit wurde angenommen, dass die Existenz einer stabilen, dreidimensionalen Struktur notwendig ist für die biologische Funktion eines Proteins. Dieses zentrale Struktur- Funktions-Dogma der Strukturbiologie wurde jedoch kürzlich durch die Entdeckung von intrinsisch ungeordneten Proteinen (IDP) grundlegend in Frage gestellt. IDPs sind aufgrund ihrer faszinierenden dynamischen und strukturellen Eigenschaften und ihrer Beteiligung an wichtigen physiologischen und pathologischen Prozessen Gegenstand intensiver Forschung. Die signifikante molekulare Dynamik in IDPs verhindert die Anwendung etablierter strukturbiologischer Methoden (Protein-Röntgenkristallographie). Im Gegensatz erlaubt die NMR-Spektroskopie einzigartige Möglichkeiten zur strukturellen und dynamischen Untersuchung von IDPs. Im beantragten Projekt wird daher versucht, experimentelle NMR- Spin-Relaxationszeit zu entwickeln, um die Strukturdynamik von intrinsisch ungeordneten Proteinen in bislang unerreichter Genauigkeit zu charakterisieren. Insbesondere werden im vorgeschlagenen Forschungsprojekt kreuzkorrelierte NMR-Relaxations-Experimente mit erhöhter, spektraler Auflösung verwendet. Die besondere technische Schwierigkeit der IDP NMR Spektroskopie ist die enorme Komplexität der experimentellen Datensätze. Dies wird durch die Anwendung höherdimensionaler NMR-Experimente entscheidend verbessert werden. Die derart verbesserte Auflösung ermöglicht die Etablierung einer automatisierten Methodenplattform und eine weitgehend automatische Analyse bislang unzugänglicher IDP Systeme. Das Potential dieser neuen Technik wird durch Anwendungen auf Osteopontin und BASP1 demonstriert, zwei IDPs, die für neuronale Plastizität und Tumorwachstum eine wichtige Rolle spielen.

Proteine sind wesentliche Komponenten lebender Organismen, wobei ihre Funktionen in ihren räumlichen (dreidimensionalen, 3D) Strukturen kodiert sind. Es gibt jedoch eine große Klasse von Proteinen -intrinsisch ungeordnete Proteine, IDPs- die im Gegensatz zu globulären Proteinen keine rigide 3D-Struktur ausbilden sondern zahlreiche Konformationen einnehmen können und dadurch neuartige biologische Funktionalitäten ermöglichen. Aufgrund dieser einzigartigen strukturellen Beweglichkeit sind diese Proteine an fundamentalen Prozessen beteiligt. Störungen der koordinierten Interaktion mit anderen zellulären Bindungspartnern führen zu diversen Krankheitsbildern (bsp. Tumorentstehung). Sie sind daher Gegenstand intensiver Forschungsanstrengungen in der Medizin und pharmazeutischen Industrie. Das Ziel der Strukturuntersuchungen von IDPs ist die Bestimmung eines strukturellen Ensembles die Gesamtheit der Strukturen, die von einem IDP eingenommen werden können. Ziel des Projekts war die Entwicklung neuartiger NMR-Methoden zur Untersuchung der strukturellen Eigenschaften intrinsisch ungeordneter Proteine. NMR ist die einzig verfügbare experimentelle Technik zur Untersuchung von IDPs und erlaubt diese flexiblen Proteine mit atomarer Auflösung zu untersuchen. Trotz einiger Erfolge in der Vergangenheit sind Anwendungen auf komplexe IDPs eingeschränkt durch die immense Überlagerung der Signale im Frequenzraum. Dieses Problem wird im Rahmen des Projektes durch Erweiterung der NMR-Experimente auf vierdimensionale Techniken und die daraus resultierende höhere Frequenzauflösung gelöst. Weiters wurden im Projekt neuartige Techniken entwickelt, die sogenannte kreuzkorrelierte Kern-Spin-Relaxation (CCR) verwenden. Durch Quantifizierung dieser Effekte können Torsionswinkel des Proteinrückgrats bestimmt werden, ein in Lösung mittels NMR Spektroskopie nicht einfach zu bestimmender Strukturparameter. Im Falle von IDPs ist die Situation zusätzlich erschwert da für jeden einzelnen Winkel im Protein kein fixer Wert vorliegt sondern durch die molekulare Beweglichkeit des Proteins ein gemittelter Wert resultiert. Zur vollständigen Charakterisierung sind daher mehrere unabhängige Experimente erforderlich. Im Rahmen des Projekts wurden drei neue CCR-Experimente zur Analyse von IDPs entwickelt. Darüber hinaus wurden einige zuvor bereits veröffentlichte NMR Experimente (die zuvor für Proteine mit einer starren Struktur verwendet wurden) für IDPs angepasst, indem sie auf vier Frequenzdimensionen erweitert wurden.