Epigenetischer Ansatz zur Entdeckung neuer Virulenzfaktoren

Bei Wirt-Pathogen-Interaktionen, wie z. B. der Interaktion einer Pflanze und einem Pilz, haben beide Teilnehmer effiziente Strategien entwickelt, um entweder den Wirt zu besiedeln (Pilz) oder den Pathogen abzuwehren (Pflanze). Wichtige Voraussetzung hierfür ist eine schnelle Anpassung an die wechselnden Umweltbedingungen, z.B. durch die Aktivierung Virulenz-/Resistenz-assoziierter Gene. Die Genaktivität wird unter anderem reguliert durch epigenetische Mechanismen, wie z.B die posttranskriptionelle Modifikation von Histonen (HPTM). Abhängig von der jeweiligen HPTM werden die darunterliegenden Gene an- oder ausgeschaltet. HPTMs stellen somit eine effiziente Möglichkeit dar, schnell auf neue Umweltreize zu reagieren. Das vorgeschlagene Forschungsprojekt mit dem Titel Epigenetischer Ansatz zur Entdeckung neuer Virulenzfaktoren macht sich diese Tatsache zu Nutze. Durch den Vergleich von Pilzmutanten mit einem veränderten HPTM Profil und zugleich einer veränderten Virulenz, sollen neue Virulenzfaktoren identifiziert werden. Für diesen Ansatz wird die noch wenig erforschte Interaktion zwischen dem Pathogen Fusarium fujikuroi und seiner Wirtspflanze Reis (Oryza sativa L.) als Modelsystem herangezogen. F. fujikuroi ist verantwortlich für die bakanae Krankheit (Krankheit der verrückten Keimlinge) und verursacht so regelmäßig hohe Ernteverluste. Symptome der bakanae Krankheit sind bleiche, spindeldürre und stark elongierte Internodien der Reispflanzen, bedingt durch die Produktion von den Pflanzenhormonen, den Gibberellinen. Diese stellen Virulenzfaktoren dar, welche während der Infektion vom Pilz sekretiert werden und so den Hormonhaushalt der Pflanze durcheinander bringen. Neben den Gibberellinen verfügt F. fujikuroi über das genetische Potenzial für die Produktion von mindestens 46 weiteren Naturstoffen, von denen einige zu dessen Virulenz beitragen könnten. Durch die Verwendung von epigenetischen Mutanten sollen Mechanismen aufgeklärt werden, die für die erfolgreiche F. fujikuroi-O. sativa Interaktion wichtig sind. Genomweite Genexpressionsanalysen von hypo-/hypervirulenten Mutanten im Vergleich zum Wildtyp sollen Gene identifizieren, welche bedingt durch die Mutation unterschiedlich reguliert werden. Einige der differentiell regulierten Gene stehen mit hoher Wahrscheinlichkeit mit der veränderten Virulenz in Zusammenhang und unterstützen so die Identifizierung neuer Virulenzfaktoren. Mithilfe der Chromatinim- munopräzipitation, durch welche die Menge einer bestimmten HPTM an ausgewählten Genen bestimmt werden kann, werden Einblicke in die epigenetischen Abläufe während der Infektion gewonnen. Basierend auf den erzielten Ergebnissen wird eine Auswahl an Genen getroffen, welche differentiell reguliert sind und idealerweise auch mit der jeweiligen HPTM korrelieren. Diese werden im Anschluss detailliert funktional charakterisiert, um ihren direkten Einfluss auf die Virulenz des Pilzes zu evaluieren. Dieses Projekt wird somit neue Erkenntnisse bezüglich der epigenetischen Regulation während der Pathogen-Wirtspflanze-Interaktion liefern.

Die meisten Pflanzenpathogene sind Pilze, und viele beinträchtigen die Ernährungssicherheit z.B. durch die Anreicherung von Mykotoxinen in infizierten Pflanzen. Das Verständnis der molekularen Prozesse während der Infektion sowie der Mykotoxinproduktion istdaher von großer Bedeutung. Die Interaktion zwischen einem Pathogen und seinem Wirt ist meist sehr spezifisch und erfordert eine individuelle und schnelle Anpassung beider Organismen aufeinander. Die Regulation der Genexpression durch Chromatin-basierte Mechanismen (zum Beispiel posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen) ermöglichen hierbei eine schnelle Reaktion zum Beipiel durch das Anschalten von Virulenz-assoziierter Gene während der Interaktion. Histon PTMs verändern hierbei nicht die DNA-Sequenz, aber beeinflussen deren Auslesung. Abhängig von der jeweiligen Histon-PTM werden die darunterliegenden Gene entweder ein- oder ausgeschaltet. Dies legt nahe, dass die "Chromatinlandschaft" (genomweite Verteilung von Histon-PTMs) eine entscheidende Determinante für eine erfolgreiche Infektion ist. Es ist daher nicht überraschend, dass viele Pilze, denen Enzyme involviert in das Schreiben, Lesen oder Entfernen bestimmter Histon-PTMs fehlen ("Chromatin-Mutanten"), hinsichtlich ihrer Entwicklung, Mykotoxinproduktion und Virulenz Defizite haben. Die Charakterisierung von "Chromatin-Mutanten" stellt somit eine vielversprechende Methode dar, um Gennetzwerke zu identifizieren, die in die Mykotoxinproduktion und/oder Virulenz involviert sind. Das übergeordnete Ziel von EPIVIRULENZ lag darin, die Relevanz von Histon-PTMs in der Interaktion zwischen Fusarium fujikuroi und Reis (Oryza sativa spp. Japonica cv. Nipponbare) zu analysieren. Mit F. fujikuroi-infizierte Reispflanzen zeigen elongierte, schlanke und chlorotische Internodien (Bakanae-Krankheit) und resultieren in enormen jährlichen wirtschaftlichen Verlusten. Verursacher dieser Symptomatik sind Gibberelline (GA), Phytohormone, welche während der Infektion vom Pilz produziert werden. Bislang ist nur wenig bekannt über weitere (GA-unabhängige) Virulenzfaktoren in diesem Pathosystem. Um zunächst Histon-PTMs zu identifizieren, die einen Einfluss haben auf die Pflanze-Pilz-Interaktion, wurden insgesamt 26 "Chromatin-Mutanten" charakterisiert. Den stärksten Einfluss auf die Virulenz hatten hierbei Stämme mit Defekten in der Histonacetylierung und Histon-3-Lysin-4-Methylierung (H3K4me). Letztere zeigten Beeinträchtigungen in der Pilzentwicklung sowie ein verändertes chemisches Profil und waren deutlich weniger virulent als der Wildtyp. Interessanterweise ist Letzteres nur teilweise auf eine verminderte GA Biosynthese zurückzuführen. Zur Identifizierung potenzieller neuer Virulenzfaktoren wurden genomweite Expressionsprofile aufgenommen, sowohl von Stämmen mit niedrigen als auch mit hohen H3K4me-Leveln, und diese mit der Wildtyp-Infektion verglichen. Hierbei war überraschend, dass nur eine kleine Untergruppe von Genen antagonistisch reguliert war, die meisten Gene also nur indirekt betroffen sind. Eine ausgewählte Gruppe an Genen wurde im Rahmen des Projektes näher untersucht. Das Hauptaugenmerk lag hierbei auf der Virulenz. Die stete Zunahme der Bevölkerungsdichte bei gleichzeitiger Abnahme der Ackerfläche, stellen uns in naher Zukunft vor ein Problem der Sicherstellung globaler Nahrungsmittelresourcen. Die Suche nach nachhaltigen Wegen zur Verhinderung von Pilzinfektionen und zur Limitierung der Mykotoxinbelastung bleibt hierbei eine zentrale Herausforderung. Die Identifizierung von Histon-PTMs als Determinanten für die Infektion und/oder Mykotoxinproduktion, und das Auffinden zusätzlicher Virulenz-assoziierter Gene hat somit großes Potential für integrative Managementstrategien in diesem Kampf.