Verbesserung von Cross-linking Massenspektrometrie Methoden

Untersuchungen zu Protein-Protein Interaktionen haben in den letzten Jahrzehnten einen wesentlichen Beitrag zu unserem Verständnis von grundlegenden biologischen Prozessen geliefert und damit die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze ermöglicht. Da jedoch bisher übliche strukturbiologische Methoden wesentlich auf der Analyse von hochreinen Proteinen mit starrer Struktur oder relativ kleinen molekularen Massen basieren, bedarf es dringend neuer Methoden um Protein-Protein Interaktionen in einem größeren Umfang zu untersuchen. Die Charakterisierung von chemisch quervernetzten Proteinen mittels Massenspektrometrie (XL-MS) erweitert bereits bestehende Methoden der Strukturbiologie um hochsensitive Analyseverfahren, die auch dynamische Strukturänderungen von mehrteiligen Proteinkomplexen in biologischen Systemen abbilden können. Obwohl die experimentellen Abläufe XL-MS basierter Methoden vergleichsweise geradlinig sind, bleibt die Identifikation von quervernetzen Peptiden mittels Massenspektrometrie schwierig. Herausforderungen hinsichtlich der Optimierung der Messung von quervernetzten Peptiden, liegen vor allem in der Variabilität biologischer Proben. Wir werden daher Sammlungen von definierten, synthetischen, chemisch quervernetzter Peptide herstellen, die dann zur systematischen Verbesserung massenspektromterischer Parameter dienen. Die Entwicklung bioinformatischer Algorithmen zur Identifikation von quervernetzten Peptiden ist schwierig, da im Gegensatz zu herkömmlichen Proteomics Experimenten, zwei Peptid-Sequenzen korrekt identifiziert werden müssen. Weiters, ist es nicht bekannt welche quervernetzten Peptide tatsächlich in Verdauen von quervernetzten Proteinen vorliegen, da unspezifische Quervernetzungen nicht ausgeschlossen werden können. Im Gegensatz dazu, bietet die Verwendung synthetischer Peptidsammlungen die Möglichkeit richtig positive Identifikationen eindeutig von falsch positiven Identifikationen zu unterscheiden. Deshalb werden wir die Datensätze, die in dieser Studie generiert werden, verwenden, um bereits bestehende Software, zur Identifikation von quervernetzten Peptiden, zu evaluieren. Des Weiteren werden wir ein standardisiertes XL-MS Protokoll entwickeln, das die Verbesserung jeden Schrittes des gesamten XL-MS Experiments ermöglichen sollen. Dieses Standardprotokoll wird auf dem Protein Cas9 basieren, das in vielen Zelllinien exprimiert werden kann. Ein derartiges Standardprotokoll stellt eine wesentliche und notwendige Grundlage für die XL-MS Gemeinschaft dar, um die Datenqualität, die mittels unterschiedlicher Ansätzen und Methoden erzeugt wird, zu vergleichen. Die Verbesserungen der XL-MS Technologie die hier erzielt werden, werden dazu beitragen neue Protein-Interaktionen zu entdecken und zu charakterisieren, und somit durch die korrekte Identifikation von quervernetzten Peptiden biologisch relevantere Ergebnisse ermöglichen.

Proteine sind die molekularen Maschinen in lebenden Zellen, die biologische Prozesse wie Wachstum, Stoffwechsel und Homöostase antreiben. Die biologische Funktion von Proteinen wird durch ihre dreidimensionale Form und durch ihre Art der Wechselwirkung mit anderen Proteinen bestimmt. Die Lösung der Struktur wichtiger Proteine und Multiproteinkomplexe ist daher ein wichtiges Forschungsgebiet, das als "Strukturbiologie" bezeichnet wird. Es werden ständig neue Instrumente entwickelt, um komplexe Proteinsysteme zu erforschen, die mit herkömmlichen Techniken nur schwer zu untersuchen sind. Herausfordernde Systeme werden häufig mit sogenannten "integrativen" Ansätzen in Angriff genommen, bei denen mit komplementären Techniken gesammelte Daten in Kombination verwendet werden, um Strukturmodelle eines Proteinkomplexes zu generieren. Die Crosslink-Massenspektrometrie (XL-MS) spielt eine Schlüsselrolle bei integrativen Methoden und wird verwendet, um Positionen von Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb eines Proteinkomplexes zu definieren. In einem Crosslink-Experiment bildet ein Reagenz eine Bindung zwischen Positionen in enger räumlicher Nähe, der Proteinkomplex wird in kurze Ketten, sogenannte Peptide, zerlegt, und mithilfe von Massenspektrometrie wird gemessen, welche Peptide aneinander gebunden haben, wodurch Wechselwirkungsstellen definiert werden. Viele Suchmaschinen wurden entwickelt, um rohe Massenspektrometriedaten in aussagekräftige Crosslink-Ergebnisse umzuwandeln. Ohne die Verfügbarkeit von "Ground Truth" -Daten zur Überprüfung der Ergebnisse bestand jedoch Unsicherheit hinsichtlich der Zuverlässigkeit solcher Dateninterpretationsstrategien. Um dieses Defizit zu beheben, haben wir Bibliotheken synthetisch vernetzter Peptide erstellt, die den einzigartigen Vorteil haben, ausschließlich Crosslinks zu enthalten, die korrekt sind, und solche, die falsch sind. Wir haben diese Bibliotheken als "Ground Truth" -Proben verwendet, um die Empfindlichkeit und Genauigkeit mehrerer gängiger Crosslink-Softwares zu testen, und die Rohdaten in einem Online-Repository als Ressource für die wissenschaftliche Gemeinschaft bereitgestellt. In unserer Studie haben wir die Massenspektrometriedaten zur Messung der Crosslink-Peptidbibliothek verwendet, um die Zuverlässigkeit gängiger Suchmaschinen zu bewerten. Wir haben die Ergebnisse auf eine geschätzte Falschentdeckungsrate von 5% gefiltert (d. H. Die Software sagt voraus, dass 5% der identifizierten Crosslinks falsch sind). Wir haben dann die Anzahl der richtigen und falschen Verbindungen gezählt, die von jeder Suchmaschine angegeben wurden, um die "berechnete" Rate falscher Entdeckungen zu bestimmen. Die Software mit dem Namen pLink identifizierte die höchste Anzahl korrekter (217), jedoch mit 28 falschen Crosslinks, was zu einer berechneten Rate falscher Entdeckungen von 11% führte, die höher ist als die geschätzten 5%. Xi und StavroX identifizierten weniger korrekte Crosslinks (186 bzw. 180), haben jedoch wie angenommen, Falschentdeckungsraten von 5% berechnet. Diese Forschung bietet eine hervorragende Ressource für die XL-Gemeinschaft. Die verfügbaren Daten können verwendet werden, um die vielen Algorithmen zu bewerten, die für die Crosslink-Identifizierung entwickelt wurden. Dies liefert wertvolle Informationen zur Leistung von Crosslink-Suchalgorithmen und ermöglicht die Auswahl geeigneter Datenanalysestrategien. Die Daten werden auch bei der Entwicklung von Crosslink-Suchmaschinen von unschätzbarem Wert sein.