Struktur und Funktion von Proteinen in Filopodien

Die Fähigkeit von Zellen sich gezielt vorwärts zu bewegen spielt in vielen physiologischen wie auch pathologischen Prozessen eine fundamentale Rolle. Embryonale Entwicklung, Wundheilung sowie eine korrekte Immunantwort setzen eine effiziente Zellmigration voraus. Eine Deregulierung der molekularen Mechanismen, welche die Fortbewegung steuern, führt in vielen Fällen zu unkontrollierter Zellmigration und kann in weiterer Folge zu Krebszellmetastasierung führen. Ein besseres Verständnis der Zellmigration kann uns deshalb helfen fundamentale Mechanismen in diversen Prozessen zu verstehen und Strategien zur therapeutischen Behandlung pathologischer Konditionen zu entwickeln. Um sich fortbewegen zu können, benötigen Zellen spezielle Strukturen, die aus einem hochkomplexen und dynamischen Filamentnetzwerk bestehen. Diese Filamente werden aus Aktin gebildet, einem der wichtigsten zellulären Bestandteile. Zu den oben genannten Strukturen gehören unter anderem sogenannte Filopodien, dünne, fingerartige Fortsätze die sich an der Zellperipherie bilden. Filopodien sind sensorische Organe der Zelle, welche eine wichtige Rolle in der direktionalen Zellbewegung, aber auch in viralen Infektionen spielen können. Die genaue Funktion von Filopodien, sowie Ihre Entstehung und Erhaltung ist bis heute nicht vollständig geklärt. Obwohl Filopodien eine recht simple Morphologie aufweisen, ist eine große Anzahl von Proteinen nötig um deren Aktinnetzwerk zu bilden. Viele dieser Proteine übernehmen eine scheinbar redundante Funktion. Wir wollen herausfinden, warum eine bestimmte Klasse von Proteinen, sogenannte Aktinfilament-Bündelproteine, in mehrfacher Ausführung in Filopodien vorkommen und welche individuelle Funktion sie besitzen. Mittels vielfältiger verschiedener Methoden wollen wir diese Proteinfunktion auf mehreren Ebenen erklären. Wir wollen analysieren, welche Funktion bestimmte Proteine auf zellulärer Ebene, als auch auch auf molekularer, ultrastruktureller Ebene haben. Hierzu kombinieren wir genetische Ansätze in welchen wir mittels CRISPR/Cas9 gezielt Proteine aus der Zelle entfernen und resultierende Effektemit Hilfe neuester Bildgebungsmethoden studieren. Dazu zählen die Kryoelektronentomographie, welche uns erlaubt intrazelluläre Strukturen in höchsten Auflösungen dazustellen, um bis dahin ungekannte Einblicke ins Zellinnere zu bekommen.

Die Regulation der Zellbewegung innerhalb eines Organismus spielt eine wichtige Rolle in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen. Um sich zu bewegen, bilden Zellen häufig periphere Strukturen, die von der zeitlichen und räumlichen Wechselwirkung zwischen verschiedenen Proteinen abhängen. Zu solchen Strukturen zählen zum Beispiel Filopodien, fingerartige Fortsätze die sich über den Zellkörper hinaus erstrecken, und welche der Zelle dabei helfen ihre Umgebung zu erkunden. Eine fehlerhafte Filopodienbildung wurde mit Krebs und viraler Infektion in Verbindung gebracht, unter anderem kürzlich bei Coronavirus-Infektionen. In diesem Projekt haben wir versucht, die Bedeutung einer Gruppe von Proteinen, sogenannter Aktin-Bündelungs-Proteine (ABPs), in der Initiierung und Aufrechterhaltung von Filopodien zu erforschen. ABPs spielen eine wichtige Rolle in der parallelen Anordnung von Aktinfilamenten, welche den Hauptbestandteil eines Filopodium bilden. Der relative Beitrag von unterschiedlichen ABPs zur Filopodienbildung bleibt jedoch unklar. Wir haben 3 verschiedene Bündelungsproteine in Krebszellen in verschiedenen Kombinationen entfernt und untersucht, wie Filopodien und Zellmigration beeinflusst werden. Unsere Untersuchungen wurden sowohl auf zellulärer Ebene (Im Mikrometer-Bereich) unter Verwendung von Lichtmikroskopie als auch auf ultrastruktureller Ebene (Im Nanometer-Bereich) unter Verwendung von Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) durchgeführt. Darüber hinaus haben wir die Bewegung von Zellen mittels "Live-Imaging"-Mikroskopie beobachtet und quantifiziert. Wir zeigen, dass die Entfernung von ABPs entgegen den Erwartungen zwar zu Defekten in Filopodien führt, die parallele Ausrichtung ihrer Aktinfilamente jedoch nicht vollständig beseitigt. Dies impliziert die mögliche Beteiligung anderer Proteine an der Aufrechterhaltung dieser fingerartigen Projektionen. Unsere Ergebnisse zeigen interessante Korrelationen zwischen der Dichte von Filopodien und der Zellmigration und auch, wie die Modulation anderer filamentöser Aktin-Netzwerke innerhalb der Zelle die Bildung von Filopodien in Abwesenheit von ABPs beeinflusst. Im Rahmen unserer Untersuchung haben wir Workflows entwickelt, die für die detaillierte ultrastrukturelle Charakterisierung von Zellen in zukünftigen Projekten nützlich sind, und so großem Wert für zukünftige Forschungsarbeit im Bereich der Zellmigration und Kryo-EM haben. Insgesamt wird Ergebnis dieses Projekts wichtige Auswirkungen auf unser Verständnis der Zellmotilität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen haben.