NMR Untersuchungen des IDPs Osteopontin auf Knochenmaterial

Das Ziel dieses Projekts war es, ein detaillierteres Bild der Wechselwirkung des menschlichen Proteins Osteopontin auf einer knochenähnlichen Oberfläche zu erlangen. Dazu wurden die Kinetik, Thermodynamik und mögliche mobile Domänen im gebundenen Zustand mit Hilfe von NMR (nuclear magnetic resonance) Spektroskopie untersucht, um die Bindungsdomänen von Osteopontin auf Hydroxylapatit-Nanopartikel zu analysieren. Das extrazelluläre Matrix-Protein Osteopontin ist ein intrinsisch ungeordnetes Protein. Diese Proteine besitzen eine ausgedehnte Konformation, ohne jedwede treibende Kraft, um eine Tertiärstruktur auszubilden. Intrinsisch ungeordnete Proteine besitzen dadurch ein enormes Potential, mit mehreren Bindungspartnern gleichzeitig wechselzuwirken. Osteopontin wird neben einer Vielzahl an physiologischen Funktionen mit Knochenmineralisierung und der Regulierung der Osteogenese in Verbindung gebracht: Inhibitor von Hydroxylapatitbildung (Hauptkomponente von Knochen: ungefähr 65 Gew%), -wachstum und -proliferation; Helfer bei intrafibrillärer Mineralisierung und Regulierer extrafibrillärer Mineralbeschichtung von Kollagen. Phosphoryliertes Osteopontin spielt hierbei eine wichtige Rolle (Phoshporylierung ist eine verbreitete posttranslationale Modifizierung von Proteinen, welche mit einer menschlichen Kinase vorgenommen werden kann). NMR Untersuchungen des phosphorylierten Osteopontins zeigen eine Zunahme an Flexibilität in den Proteinregionen, in denen phosphorylierte Aminosäuren enthalten sind, und reduzierte langreichweitige Wechselwirkungen, und somit eine Dekompaktierung der Struktur. NMR Experimente an Osteopontin, das auf Hydroxylapatit-Nanopartikeln wechselwirkt, kann mehrere Tage in Anspruch nehmen. Die Zugabe von Methylcellulose zum Messpuffer als geeignete und einfache Option herausgestellt, um eine stabile Suspension der Nanopartikel zu garantieren und eine Sedimentierung zu verhindern, und gleichzeitig eine lösungsähnliche Umgebung für die Proteine zu bewahren. NMR Untersuchungen zeigen verschiedene Bindungsmoden des Osteopontins (phosphoryliert und unphosphoryliert) beim Wechselwirken auf Hydroxylapatit. Das unphosphorylierte Osteopontin bindet schwach auf der mineralischen Oberfläche, wobei der Bereich seines primären kompakten Zustands unverändert bleibt und nicht mit der Hydroxylapatitoberfläche wechselwirkt. Im Gegenteil dazu bindet das phosphorylierte Osteopontin, welches aufgrund der Hyperphosphorylierung weniger langreichweitigere Wechselwirkungen und somit eine ausgedehntere Struktur besitzt, über die volle Länge auf der Mineraloberfläche, weil die phosphorylierten Stellen breit gefächert über die Proteinstruktur verteilt sind. Außerdem weißen die Daten darauf hin, dass die Struktur des phosphorylierten Osteopontins auch während der Bindung zu Hydroxylapatit elongiert bleibt und die Mineraloberfläche bedeckt. Bei beiden Proteinen, dem un- und phosphorylierten Osteopontin handelt es sich um eine elektronegative Bindung zur Hydroxylapatitoberfläche. Außerdem kann keine Änderung der Konformation während der Bindung festgestellt werden. Die verschiedenen Bindungsmodi können jedoch die unterschiedlichen biologischen Funktionen von unphosphoryliertem und phosphoryliertem Osteopontin während der Osteogenese und Biomineralisierung erklären: der eher "bedeckende" Bindungsmodus des phosphorylierten Proteins könnte sowohl seine Funktion als Inhibitor der Mineralisierung erklären, da die Mineraloberfläche durch sterische Hinderung von weiterem Wachstum gehemmt wird, als auch seine Fähigkeit, Pseudo-Übergangskoazervat-Phasen aus Calciumphosphat zu stabilisieren.