2D FTMS Charakterisierung von modifizierter RNA und Histonen

In den Zellkernen von Pflanzen-, Tier- und menschlichen Zellen ist DNA um ein komplexes System aus speziellen Proteinen gewickelt, sogenannten Histonen. Wenn DNA entwunden wird, um der Zelle als Bauplan für die Proteinsynthese zu dienen, wird diese zuerst in Ribonukleinsäure (RNA) umgeschrieben, die aus dem Nukleus transportiert wird, um wiederum in Proteine übersetzt zu werden. Sowohl Histone als auch RNA werden in den Zellen chemisch modifiziert. Diese Modifikationen beeinflussen unter anderem die frühe Entwicklung, Entzündungsprozesse und Neurodegeneration, jedoch ist ihre genaue Rolle bisher nur unzureichend verstanden. Um die Funktion dieser Modifikationen in biologischen Prozessen zu verstehen ist es wichtig, die genauen Sequenzen von Histonen und RNA zu wissen und das Vorkommen jeder Modifikation in verschiedenen biologischen Proben aus RNA und Histonen zu quantifizieren. Fourier-Transformation Ionenzyklotronresonanz Massenspektrometrie (FT-ICR MS) ist eine leistungsstarke Methode zur Messung der Masse von intakten, ionisierten Molekülen. Diese elektrisch geladenen Teilchen bewegen sich in elektrischen und magnetischen Feldern eines Massenspektrometers, wobei die Bewegung vom Verhältnis zwischen Masse und Ladung abhängt. Diese Bewegungen werden im FT-ICR MS gemessen und in ein Masse-zu-Ladung- Verhältnis für jedes Molekülion konvertiert. Darüberhinaus können diese Ionen durch Interaktionen mit neutralen Gaspartikeln, Photonen oder Elektronen in kleinere Fragmente zerbrochen werden. FT-ICR MS kann, durch Messung dieser Bruchstücke, für die Sequenzanalyse von Histonen und RNA verwendet werden, Modifikationen identifizieren und lokalisieren, und diese sogar quantifizieren. Standard FT-ICR MS Experimente können jedoch nur ein Molekül auf einmal charakterisieren. In biologischen Proben ist es schwer, Gemische von Histonen oder RNA zu separieren, und neue Vorgehensweisen für die Analyse von Mixturen sind daher notwendig. Zweidimensionale Massenspektrometrie (2D MS) ist eine vielversprechende Methode, die auf einer periodischen Modulation der Ionenbewegung im FT-ICR Massenspektrometer beruht. Mit 2D MS soll die zeitgleiche Analyse von RNA- oder Histon-Mischungen bezüglich ihrer Sequenz und chemischen Modifikationen unkompliziert gemacht werden. In diesem Projekt werden wir 2D MS zur detaillierten Analyse von modifizierter RNA und Histonen entwickeln, einschließlich der Identifikation, Lokalisation und relativen Quantifizierung der Modifikationen. Die neu entwickelte Methode wird den Grundstein für zukünftige Studien legen, in denen die biochemische Funktion von RNA- und Histonmodifikationen sowie ihre Rolle in biologischen Prozessen erforscht werden können.

2D FT-ICR MS for the Structural Characterization of Modified RNA and Histones In Zellkernen von Pflanzen und Tieren ist die DNA um spezielle Proteine gewickelt, die Histone genannt werden. Um als Blaupause für die Proteinsynthese zu dienen, wird die DNA zunächst entwunden und dann in Ribonukleinsäure (RNA) transkribiert, die aus den Zellkernen transportiert wird, um an den Ribosomen für Proteine zu kodieren. Sowohl Histone als auch RNA werden in vivo chemisch modifiziert. Diese Modifikationen haben einen Einfluss auf die frühe Entwicklung, Entzündungen und Neurodegeneration, aber ihre genaue Rolle muss noch untersucht werden. Dazu ist es wichtig, die genaue Sequenz von Histonen und RNA aus biologischen Proben zu bestimmen und ihre Modifikationen exakt zu lokalisieren und zu quantifizieren. Die Massenspektrometrie ist eine analytische Methode, die häufig zur Sequenzierung von Biomolekülen verwendet wird. Mischungen von RNA oder Histonen aus biologischen Proben sind jedoch oft schwierig zu trennen, weshalb neue Ansätze für ihre Charakterisierung benötigt werden. Die zweidimensionale Massenspektrometrie (2D-MS) kann Fragmente mit Vorläufern korrelieren, wodurch die gleichzeitige Sequenzierung von RNA oder Histonen in Mischungen und die Identifizierung und Lokalisierung ihrer chemischen Modifikationen möglich wird. Eine große Herausforderung für die 2D-MS ist das Auflösungsvermögen, das für die Charakterisierung größerer Biomoleküle erforderlich ist. Nach der Installation von 2D MS an der Universität Innsbruck haben wir uns daher zunächst auf die Entwicklung neuer Ansätze konzentriert, die wir dieser Limitation entgegensetzen können. Unter Verwendung von Mischungen von Histonpeptiden mit typischen Modifikationen wie Methylierung und Acetylierung haben wir "narrowband" 2D MS entwickelt, um die Genauigkeit von 2D MS im Vergleich zu regulärer "broadband" 2D MS deutlich zu erhöhen, und wir konnten zeigen, dass diese neue Technik besonders für die Analyse großer Biomoleküle wie Histonen und RNA geeignet ist. Darüberhinaus haben wir Algorithmen für "absorption mode" 2D MS entwickelt, die die Datenverarbeitung verbessern und die spektrale Genauigkeit und damit die aus 2D-Massenspektren gewonnenen Informationen verdoppeln. Für Histonpeptide mit Modifikationen, die sich um eine Masse entsprechend der von nur 10 Elektronen unterscheiden, konnten wir zeigen, dass die Kombination aus "narrowband" und "absorption mode" 2D MS eine eindeutige Zuordnung von Fragmenten zum richtigen Histon erlaubt. Durch die Analyse verschiedener Mischungen von Histonpeptiden mit unterschiedlichen Modifikationen konnten wir weiter erstmals zeigen, dass 2D MS zur Quantifizierung ortsspezifischer Modifikationen von Biomolekülen verwendet werden kann. Darüberhinaus haben wir die neu entwickelten Ansätze zur Charakterisierung von modifizierter RNA und Liganden-gebundener RNA verwendet und in Zusammenarbeit mit der Tschechischen Akademie der Wissenschaften 2D MS auf die Analyse anderer modifizierter Proteine erweitert.