Deep Brain Vision: Adaptive 3D-Zwei-Photonen-Mikroskopie

Weiterer Forschungskontext: Die funktionelle Bildgebung von zellulären und subzellulären Prozessen tief im lebenden Gehirn ist eine der am meisten gewünschten Fähigkeiten in den Neurowissenschaften, steht jedoch vor erheblichen Herausforderungen. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wurden nichtlineare optische Mikroskopien entwickelt, die eine subzelluläre Auflösung bei hohen Abbildungsgeschwindigkeiten bieten, aber Aberrationen und Streuung die Tiefe begrenzen, in der diese angewendet werden können. Die Abbildungstiefe kann durch Verwendung noch längerer Wellenlängen und / oder adaptiver Optiken (AO) erhöht werden, die Wellenfrontaberrationen korrigieren. Trotz erheblicher Fortschritte bei der Erhöhung der Abbildungstiefe gibt es aufgrund zweier großer Herausforderungen immer noch keine realistischen Implementierungen von AO in stark streuenden Proben: (i) schnelle und genaue Messungen von Wellenfrontaberrationen (ii) Erweiterung der Korrekturen über größere Sichtfelder ( FOV). Ziele: Wir schlagen vor, einen neuartigen AO-Ansatz für die nichtlineare Rastermikroskopie zu entwickeln, der die Bildgebung mit subzellulärer Auflösung über ein erweitertes Sichtfeld durch stark streuende Gewebe ermöglicht und gleichzeitig die Bildgebungsgeschwindigkeit erreicht, die zur Aufzeichnung der Dynamik in lebenden Geweben erforderlich ist. 3D-Bildgebungsfunktionen werden mithilfe eines neuartigen Fernfokussierungsschemas bereitgestellt. Darüber hinaus werden wir die Wirksamkeit unseres Ansatzes mithilfe numerischer Simulationen und Experimente an relevanten biologischen Proben wie Gehirn- und Hautgewebe bewerten. Methoden und Originalität: Wie bei der herkömmlichen AO korrigieren wir Aberrationen, die über das gesamte Sichtfeld bestehen, mit einem verformbaren Spiegel. Zusätzlich korrigieren wir starke, feldabhängige Streuung mit einem Flüssigkristall-Raumlichtmodulator (SLM) mit hoher Pixelanzahl, der in das Probenvolumen (konjugiertes AO) abgebildet wird. Um die Geschwindigkeit der Korrektur zu maximieren, werden wir konjugiertes AO mit einer kürzlich eingeführten Technik namens F- SHARP kombinieren, die schnelle Korrekturen auch bei langsamen SLMs ermöglicht. Die Fähigkeit, feldabhängige Turbulenzen mit Millionen von Pixeln in Echtzeit zu korrigieren, wird neuartig und möglicherweise bahnbrechend für die Tiefengewebebildgebung sein. Wir werden strenge numerische Simulationen durchführen, um optimale Parameter zu identifizieren und die Wirksamkeit unserer Technik für verschiedene Gewebetypen und Bildgebungsmodalitäten experimentell zu bewerten. Wir werden eine neue Fernfokussierungsmethode vorstellen, die auf diffraktiven drehbaren Elementen basiert, die mit Optiken mit hoher NA kompatibel sind und eine intrinsische Korrektur von sphärischen Aberrationen ermöglichen. Schließlich werden wir die Anwendung von konjugiertem AO auf die Bildgebung der zweiten Harmonischen (SHG) in biologischen Geweben untersuchen, die bisher nicht berücksichtigt wurde. Primärforscher: Der Antragsteller (Dr. Molly May) wird die numerischen Simulationen, den Aufbau und den Betrieb des vorgeschlagenen Mikroskops durchführen. Assoc. Prof. Alexander Jesacher und Prof. Monika Ritsch-Marte werden die Aktivitäten überwachen, sowie Dr. Michiel Langeslag und Assoc. Prof. Sandrine Moreno-Dubrac wird bei den biologischen Untersuchungen zusammenarbeiten und Proben zur Verfügung stellen.

Die Struktur und Funktion des lebenden Gehirns zu verstehen, ist eines der wichtigsten Probleme unserer Zeit. Um die neuronalen Schaltkreise, die der Aktivität des Gehirns zugrunde liegen, wirklich zu verstehen, müssen wir einzelne Neuronen mit Zellkörpern v on nur 10 Mikrometern auflösen, ohne das Gewebe zu stören, was mit bestehenden Techniken nicht möglich ist. Der vielversprechendste Ansatz zur Abbildung der Aktivität einzelner Neu ronen besteht darin, die Neuronen so zu modifizieren, dass sie fluoreszier en, wenn sie aktiv sind. Diese Fluoreszenz kann in einem Mikroskop abgebildet werden, um die neuronalen Verbindungen abzubilden. Hirngewebe ist jedoch nicht transparent es streut das Licht, was es schwierig macht, tiefer als die obersten Schichten des Gehirns zu blicken und mit normaler Fluoreszenz Bildgebung unmöglich durch den Schädel zu sehen. Um dieses Problem anzugehen, können Wissenschaftler mit einer Technik namens Zwei - Photonen-Fluoreszenzmikroskopie (TPEF) verschiedene Lichtfarben im Infrarot- Wellenlängenbereich verwenden, die weniger empfindlich gegenüber Streuung durch das Gewebe sind. Diese Technik kann die erreich bare Abbildungstiefe nahezu verdoppeln. Kürzlich wurde ein weiterer Ansatz entwickelt, der eine "Inverse" der Streuung erzeugt, die auf einem bestimmten Weg durch das Hirngewebe auftritt, und den Effekt der Streuung aufhebt. Diese Streuungskompensationstechnik bietet ein enormes Potenzial, die optische Abbildungstiefe im Hirngewebe zu erhöhen, aber es ist schwierig, das korrekte i nverse Streuungsprofil zu bestimmen, das sich an jeder Position in der Probe ändern kann. Hier haben wir einen Ansatz entwickelt, um dieses inverse Streuprofil in wenigen Sekunden schnell zu bestimmen. Wir kombinierten die Streuungskompensationstechnik mit TPEF, um Mikrogliazellen über 0,5 mm Tiefe im Hirngewebe von Mäusen abzubilden. Mit unserer Streuungskorrektur kann die Signalhelligkeit um das bis zu 20 -fache gesteigert und Zellstrukturen mit 300 nm Ortsauflösung abgebildet werden. Wir begannen au ch einen Technologietransfer, der unser neuartiges Mikroskop im Labor unserer Mitarbeiter am Physiologischen Institut duplizieren sollte. Dort werden wir zusammenarbeiten, um die Technik anzuwenden, um lebendes Gewebe und die Gehirnaktivität in lebenden Mäusen abzubilden.