Molecular identification of interactions of transfer RNA with the ribosome at the ribosomal P and A sites

Die korrekte Bindung der transfer RNA (tRNA) an das Ribosom ist die Voraussetzung für den wichtigsten Prozeß der Zelle, die Proteinbiosynthese. Die tRNA Bindung an das Ribosom ist gekoppelt mit der selektiven Bindung an das Kodon der mRNA. Jedoch muß auch die tRNA vom Ribosom direkt koordiniert und kontaktiert werden. Ziel dieses Projektes ist die Lokalisierung von interagierenden Partner in tRNA und Ribosom von denen bisher noch keine nachgewiesen wurden. Durch die geringe Sequenzkonservierung der tRNAs wird angenommen, daß die tRNAs aufgrund der ihnen gemeinsamen (Tertiar-)Struktur vom Ribosom erkannt werden und daß diese Interaktionen über das Rückrat der RNA Kette verlaufen. Daher ist eine Fortführung zweier erfolgreicher experimenteller Ansätze geplant, bei der die Rollen der 2-hydroxyl Gruppen im Antikodon Bereich bzw. der der Phosphatgruppen in der tRNA für die Ribosomen Bindung erforscht wurde. Durch Verwendung von modernster RNA Technologie, d.h. bestimmten Modifizierungen bzw. Nukleotidanaloga soll Aufschluß über wichtige Rückgratgruppen der tRNA für die Bindung an die 30S ribosomale Untereinheit bzw. an 70S Ribosomen von E. coli gewonnen werden. Beide Ansätze, die Erkundung des Rückrats der tRNA und der der Basen in der 16S rRNA, sollen anschließend kombiniert werden. Erstmalig wurde ein Projekt entwickelt, daß ein systematisches Screening zur Identifizierung von interagierenden Partner auf molekularer Ebene erlaubt. Verschiedenen Ansätze (einfacher und doppelter Interferenzansatz, RNA footprinting) sollen die Erfolgsrate erhöhen. Die gesammelten Ergebnisse sollen in das noch unvollständige dreidimensionale Modell der 16S rRNA eingebaut werden zur Überprüfung und Weiterführung des Modells und eventuell gewonnene Erkenntnisse durch das Modellieren experimentell bewiesen werden.

Wir beschreiben eine schnelle und einfache ein-Schritt Affinitätsaufreinigung für die Isolierung von spezifisch RNA-bindenden Proteinen. Eine in vitro transkribierte hybrid RNA bestehhend aus einer Aptamer Sequenz mit hoher Bindungsaffinität zum Antibiotikum Streptomycin und eine mögliche Protein-bindende RNA Sequenz wird mit Rohzellextrakt inkubiert. Nach Komplexbildung wird der Ansatz auf eine Affinitätschromatographie-Säule mit immobilisiertem Streptomycin gegeben. Die Bindung des in vitro assemblierten RNA-Protein Komplexes zur Streptomycin-Matrix ist durch die Aptamer RNA vermittelt und die spezifisch gebundenen Proteine werden mitttels Elution mit Antibiotikum gewonnen. Durch Verwendung von zwei gut charakterisierten RNA-Protein Interaktionen wurde die Qualität dieser neuen Methode getestet. Das U1A Protein und das Bakteriophagen Protein MS2 konnten mittels ihren spezifischen RNA Motiven aus Hefe Rohzellextrakt in hoher Ausbeute und Reinheit in nur einer Runde der Affinitätsreinigung gewonnen werden. Da die Aufreinigungmethode unabhängig vom Extraktherkunft ist, kann diese Methode des StreptoTag` für Extrakte von anderen Organismen verwendet werden. Diese Methode ist daher ein universell einsetzbares tool` zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen.