Genetic regulation and enzymatic reaction of DI!2 and DIT1, two sporulation-specific genes of saccharomyces cerevisiae

Ziel des Projektes war es, die genaue biochemische Funktion der beiden in unserem Labor entdeckten Gene DIT1 und DIT2 aufzuklären. Die beiden Gene werden nur während einer kurzen Periode in de mittleren bis späten Hefesporulation transkribiert. Ihre biologische Funktion ist die Biosynthese der Aussenwand der Spore, die die Spore resistent gegen Verdauungsenzyme und andere Umwelteinflüsse macht. Die Spore dient nicht nur zur Rekombination und sexuellen Vermehrung, sondern ist auch die Verbreitungsform der Hefe. Im ersten Teil des Projektes zeigten wir, dass DIT2, welches Sequenzhomologie zur Cytochrom P450 Superfamilie zeigt, tatsächlich das dritte Cytochrom P450 der Hefe ist. Ebenso wie die anderen beiden Cytochrome P450 ist Dit2p im endoplasmatischen Reticulum lokalisiert und benötigt zu seiner Funktion Cytochrom P450 Reductase. Wir etablierten mit Mikrosomen aus Hefe, die ektopisch Dit2p exprimiert, ein in vitro System für die enzymatische Reaktion, die von Dit2p katalysiert wird. Dit2p ist ein atypisches Cytochrom P450 das eine Oxidase-reaktion katalysiert. Zwei Moleküle N-Formyl-Tyrosin werden oxidiert, wobei ein Molekül Bis-N-Formyl-Dityrosin entsteht. Als Kosubstrate werden NADPH und molekularer Sauerstoff benötigt, der nicht ins Substrat eingebaut, sondern zu Wasser reduziert wird. Bis-N-Formyl-Dityrosin wird im weiteren deformyliert, epimerisiert und in das hochquervernetzte Makromolkül der Sporenwandaussenschicht eingebaut. Die stereochemische D-Konformation eines Teils der Dityrosinmoleküle trägt zur Resistenz gegen Proteasen bei. Dit1p katalysiert die Formylierung von Tyrosin, welche der Oxidation unmittelbar vorausgeht. Dieser Schritt hängt interessanterweise nicht von Tetrahydrofolsäure ab. In Ermangelung eines funktionellen in vitro Systems für die DIT1-katalysierte Reaktion können wir über die molekularen Details der Formylierung nichts aussagen. Wir untersuchten die Regulation der Transkription von DIT1 und DIT2, die auf Chromosom IV (divergent) benachbart liegen und von einer gemeinsamen Kontrollregion aus gesteuert werden. Wir identifizierten einen neuen vegetativen Repressor der DIT Gene, Spt10p, und zeigten, dass eine Deletion dieses Gens denselben Phänotyp aufweist, wie die drei rezessiven Allele, die in dem ursprüngichen Mutantenscreen isoliert wurden. SPT10 ist zusätzlich ein Aktivator der Sporulation. Die Deletionsmutante zeigt ein breites Spektrum von pleiotropen Phänotypen, worunter auch irreguläre Segregation der Chromosomen in Mitose und Meiose fällt. Sequenzvergleiche deuten darauf hin, dass Spt10p eine Histondeacetylase sein könnte. Wir entdeckten ein neues cis-wirksames Repressorelement, DRE, in der DIT intergenischen Region und zeigten, dass ein noch nicht näher charakterisiertes Protein an dieses palindromische Element bindet, welches nicht mit Spt10p identisch ist. Unsere Resultate sind wesentliche Beiträge zum Verständnis der Zelldifferenzierung in einem basalen eukaryotischen Modellsystem.