Mutagenesis and expression of nitric oxid synthase

Stickstoffmonoxid (NO) stellt ein im Organismus weit verbreitetes inter- und intrazelluläres Signalmolekül dar. In vielen biologischen Systemen führt es als endogener Aktivator der löslichen Guanylylzyklase zu einem Anstieg der intrazellulären cGMP-Konzentration. Die daraus resultierende Aktivierung von Proteinkinasen und Phosphorylierung von Proteinen löst die eigentliche Zellantwort aus. Über diesen Mechanismus führt NO u.a. im kardiovaskulären System zur Relaxation von Blutgefäßen und reguliert im Gehirn die Freisetzung von Neurotransmittern. Im Rahmen des vorliegenden Projektes werden Untersuchungen zur Funktion und physiologischen Regulation von NO-bildenden Enzymen (NO-Synthasen; NOS) durchgeführt. Für die geplanten Untersuchungen sollen verschiedene Isoformen des Enzyms (neuronale, endotheliale und induzierbare NOS) mit Hilfe geeigneter Expressionssysteme gentechnisch hergestellt, gereinigt und biochemisch/biophysikalisch charakterisiert werden. Zusätzlich soll durch gentechnische Veränderung der DNA (Punkmutation, Deletionsmutation) Enzymmutanten und Enzymfragmente exprimiert und charakterisiert werden, um so Anhaltspunkte für die Bedeutung verschiedener Enzymdomänen bei der Biosynthese von NO zu erhalten. Insbesonders soll die bislang noch nicht identifizierte Bindungsdomäne für den essentieller Kofaktor Tetrahydrobiopterin (BH4) am Enzym lokalisiert und charakterisiert, sowie der Einfluß von BH4 auf die Tertiär- und Quartär-Struktur des Enzyms untersucht werden. Weiters soll geklärt werden, welche Rolle der N-Terminus der neuronalen NOS bei der Assoziation des Enzyms an Membranstrukturen spielt und inwieweit die Interaktion mit Membranproteinen zu einer Änderung der Enzymstruktur bzw. Enzymfunktion führt. Anhand dieser Untersuchungen sollen weitere Informationen über den molekularen Aufbau des Enzyms und dessen Funktion gewonnen, sowie ein wesentlicher Beitrag zur Aufklärung des Reaktionsmechanismus der Biosynthese von NO geliefert werden.