Bildung des Ca2+ Kanalkomplexes in der Skelettmuskel Triade: Identifikation des targeting-Signals der alpha1-Untereinheit des L-Typ Ca2+ Kanals

Die Funktion von Ca2+ Kanälen in der Zelle hängt wesentlich von deren spezifischer Anordnung in örtlich begrenzten Membrandomänen ab. Die Signale und zellulären Mechanismen, die zu spezifischem Einbau (targeting) von Ca2+ Kanälen in erregbaren Zellen führe, sind großteils unbekannt. In diesem Projekt nützen wir unterschiedliche targeting-Eigenschaften zweier Ca2+ Kanäle, um die molekularen Signale zu identifizieren, die für den spezifischen Einbau des Ca2+ Kanals in die Skelettmuskel-Triade notwendig sind. Plasmide, die chimäre Ca2+ Kanäle, zusammengesetzt aus Skelett- und neuronaler Isoform codieren, sollen hergestellt und in dysgenen Myotuben exprimiert werden. Die Analyse der targeting-Eigenschaften dieser Chimäre mittels Immunicytochemie und Lokalisation des Green Fluorescent Proteins zeigt den Sitz des tareting-Signals in der primärstruktur des Ca2+ Kanals an. Das targeting-Motiv wird weiters mit Hilfe von Punktmutationen charakterisiert und seine Spezifität anhand Übertragbarkeit seiner Funktion auf heterologe Membranproteine getestet. Die Kanaleigenschaften und Funktion in der Erregungs-Kontraktions-Kopplung von jenen heterologen Kanälen, die in die Triade eingebaut wurden, werden mittels Patch-Clamp- und mikrofluorometischen Ca2+ Messungen analysiert. Das targeting-Signal repräsentiert eine wichtige funktionelle Domäne des spannungs-aktivierten Ca2+ Kanals. diese zu kennen ist von großer Bedeutung für die Entschlüsselung jener Mechanismen, die an der Bildung der Triade und an der Differenzierung von spezialisierten Membrandomänen in erregbaren Zellen beteiligt sind. Die molekularen und zellulären Hilfsmittel, die in diesem und dem vorangegangenen Projekt entwickelt wurden, werden weiters für die Lokalisation und funktionelle Charakterisierung des Typ 3 Ryanodinrezeptors und von neuen Triadenproteinen im Skelettmuskel verwendet.

2+ Ca Kanäle spielen eine zentrale Rolle in physiologischen Prozessen wie der Muskelkontraktion, bei Lernen und Gedächtnis, oder bei Sekretionsvorgängen. Um diese Vielzahl von Funktionen zu erfüllen, müssen Ca2+ Kanäle präzise in spezifische Strukturen der jeweiligen Zellen eingebaut werden. Die Mechanismen, für diesen gerichteten Einbau (Targeting) sind weitgehend unbekannt. Im Rahmen dieses Projektes, konnten wir nun zum ersten Mal eine Aminosäure-Sequenz im Ca2+ Kanal beschreiben, die als Signal (gleichsam der Adresse) für dessen funktionellen Einbau in die Skelettmuskel Triade dient. Ein Defekt im Erbgut führt zum Fehlen eines Ca2+ Kanals in den Skelettmuskeln der Dysgenen Maus und somit zum Tod der Tiere bei der Geburt aufgrund von Atmungsversagen. In Zellkultur können Muskelzellen dieser Mausmutante aber am Leben erhalten werden. Führt man nun - mit Methoden der modernen Zellbiologie - eine normale Kopie des Ca2+ Kanal-Gens in diese dysgenen Muskelzellen ein, so beginnen sie wieder zu kontrahieren. Das rekombinante Ca2+ Kanal-Gen ersetzt den fehlenden Kanal, dieser wird an der richtigen Stelle in der Muskelzelle eingebaut und die normale Funktion des Muskels wird so wieder hergestellt. Dieser methodische Ansatz entspricht einer Gentherapie in der Zellkultur und kann für Untersuchungen von Struktur und Funktion des Ca2+ Kanals genützt werden. Ersetzt man zum Beispiel das defekte Muskelgen mit einem falschen Ca2+ Kanal aus Neuronen, so wird dieser zwar in der Zelle synthetisiert, aber nicht in die Triade (die Struktur in der Muskelzelle in der der Ca2+ Kanal normal vorkommt) eingebaut. Nun kann man mit molekularbiologischen Methoden Chimären, bestehend aus Teilen beider Kanaltypen, oder auf andere Weise veränderte Kanäle herstellen und deren Eigenschaften in der Muskelzelle untersuchen. Auf diese Weise konnten wir im Laufe dieses Projektes die Funktion und Wirkungsweise verschiedener Regionen des Ca2+ Kanalproteins charakterisieren: (1) Eine Domäne im Kanal, die für die Assoziation der Kanaluntereinheit verantwortlich ist, ist auch wichtig für die Modulation der Bindungsstelle für Pharmaka. (2) Die Region, die für die Aktivierung der Ca2+ Freisetzung und somit für die Aktivierung der Muskelkontraktion verantwortlich ist, konnte genauer definiert werden. (3) Eine 55-Aminosäuren lange Sequenz nahe des C-Terminus des Kanals beinhaltet jene Information, die für den gerichteten Einbau des Kanals in der Triade verantwortlich ist. Wird diese Sequenz vom Skelettmuskel-Kanal auf den neuronalen Kanal übertragen, kann man damit diesen Kanal in die Muskel Triade lenken, wo er dadurch in der Lage versetzt wird, die Muskelkontraktion auszulösen. Diese Ergebnisse sind von großer Bedeutung für unser Verständnis der Funktionsweise dieser wichtigen Gruppe von Molekülen, den Ca2+ Kanälen, und sie helfen uns den Aktivierungsmechanismus der Muskelkontraktion zu verstehen. Überdies erlaubt uns dieses experimentelle System genetisch bedingte Muskelkrankheiten zu simulieren (z.B. Maligne Hyperthermie), und somit die zellulären Vorgänge in der Kranheitsentstehung zu untersuchen. In der Erforschung dieser bio-medizinischen Grundlagen, kommen die in Innsbruck entwickelten Zellsysteme mittlerweile weltweit zum Einsatz.