Pharmakonbindungsstellen von Kalziumkanälen

Ein therapeutischer Nutzen pharmakologischer Modulation sogenannter "Non-L-type" Ca2+-Kanäle im Säuger- Hirn wurde für neuroprotektive und potente analgetische Wirkungen belegt. "Non-L-type" Ca2+-Kanalblocker werden als vielversprechende Wirkstoffe zur Schmerztherapie, der Behandlung von Schlaganfällen, sowie möglicherweise von Migräne bewertet. Allerdings sind bislang keine nicht-peptidischen Verbindungen, die für den Routineeinsatz in der Klinik geeignet wären, bekannt. Das Ziel des als Antrag vorliegenden Projektes besteht in der stukturellen Analyse zweier distinkter Domänen der alpha1 -Untereinheit von "non-L-type" Ca2+-Kanälen, welche potentiell als Bindungsstellen für innovative Pharmaka dienen könnten. Die erste Domäne entspricht jener Region der alpha1-Untereinheit von "non-L-type" Ca2+-Kanälen, welche für die Interaktion mit Ca2+-Kanalmodulatoren aus der Klasse der 1,4-Dihydropyridine verantwortlich zeichnet. Mittels gerichteter Mutagenese und "Molecular Modelling" soll der molekulare Aufbau dieser Bindungsstelle analysiert und eine detaillierte Struktur-Aktivitätsbeziehung des Komplexes bestehend aus 1,4-Dihydropydidin und Ca2+- Kanal alpha1 -Untereinheit ermittelt werden. Diese strukturelle Information wird anschließend zur strukturellen Vorhersage für nichtpeptidische Verbindungen verwendet, die selektiv mit den entsprechenden Regionen der "Non- L-type" Ca2+-Kanäle interagieren. Die zweite Domäne ist eine zytoplasmatische Schleife, welche die transmembranären Domänen I und II der alpha1 -Untereinheit verbindet und die hochaffine Interaktion mit der Ca2+-Kanal-beta-Untereinheit vermittelt. Verbindungen, welche diese Assoziation verhindern, werden als Blocker von Ca2+-Kanälen bewertet. Andererseits könnten Pharmaka, welche die Bindung der beta-Untereinheit nachahmen, als Ca2+-Kanal-Aktivatoren eingesetzt werden. Die nahezu irreversible Bindung der beta-Untereinheit an die alpha1-Untereinheit wird durch ein 18-50 Aminosäuren umfassendes Bindungsmotiv (AID) innerhalb dieser Verbindungsschleife und einen konservierten Abschnitt von 50-200 Aminosäuren (BID) der beta-Untereinheit vermittelt. Als erster Schritt auf der Suche nach therapeutischen Prinzipien zur Beeinflussung der Interaktion zwischen AID und BID wird die dreidimensionale Struktur eines rekombinanten, hochaffinen AID-BID-Komplexes mittels NMR-Spektroskopie ermittelt. Anschließend sollen unter Verwendung des "phage-display-systems" kurze Peptide mit hoher Affinität für AID oder BID aus einer "random-display-library" isoliert und sowohl biochemischer als auch elektrophysiologisch im Hinblick auf ihre Potenz in der Blockade der AID-BID-Interaktion untersucht werden. Die durch NMR ermittelte dreidimensionale Struktur der gebundenen Peptide kann folgerichtig dazu eingesetzt werden strukturelle Vorhersagen über nicht-peptidische Strukturen zu treffen, welche imstande sind, die Funktion von "Non-L-type" Ca2+-Kanälen zu modulieren. Diese umfassende Kombination experimenteller Verfahren, welche gerichtete Mutagenese, NMR-Spektroskopie, Molekulares Modelling, Einsatz von "random-peptide-libraries", sowie biochemische und elektrophysiologische Untersuchungen einschließt, stellt eine solide, strukturelle Grundlage für die Entwicklung innovativer "Non-L- type" Ca2+-Kanal-Modulatoren mit potentiell therapeutischem Nutzen dar.

Spannungsabhängige Kalziumkanäle besitzen die wichtige Aufgabe, in elektrisch erregbaren Zellen (wie z.B. Muskel und Nervenzellen) die elektrische Erregung in ein intrazelluläres Signal umzuwandeln. Dabei bedienen Sie sich des Einstroms von Kalziumionen in die Zelle. Dieses Kalziumsignal führt in der Folge zur gewünschten Zellantwort, wie Muskelkontraktion oder Freisetzung von Neurotransmittern. Damit kontrollieren diese Kalziumkanäle wichtige Körperfunktionen, wie Blutdruckregulation, Herzaktivität und sämtliche Funktionen des Gehirns. In diesem Forschungsprojekt konnte nachgewiesen werden, dass Mutationen in Kalziumkanälen ihre Funktion so ändern können, dass sie zu bestimmten Erkrankungen führen. Mutationen in jener Kalziumkanaluntereinheit, die für die Aktivität sog. P/Q-Typ Kanäle verantwortlich ist, führen zu einer seltenen erblichen Form der Migräne, sog. Familiärer Hemiplegischer Migräne (FHM). Damit steht ein ausgezeichnetes Modell zur Verfügung, in welchem geprüft werden kann, welche Auswirkungen diese Mutationen auf die Kalziumkanalfunktion besitzen. Aus den Funktionsänderungen kann geschlossen werden, welche pathophysiologischen Mechanismen einem Migräneanfall zugrunde liegen und ob Modulatoren dieser Kanäle neue gegen Migräne wirksame Pharmaka darstellen könnten. Unsere Untersuchungen haben ergeben, dass FHM Mutationen die zu charakteristischen Veränderungen der Kalziumkanalfunktion führen. Diese erzeugen schon bei Erregungen von Nervenzellen, die in gesunden Neuronen P/Q-Typ Kanäle nicht aktivieren, deutlichen Kalziumeinstrom in die Zelle. Diese Übererregbarkeit der P/Q-Typ Kanäle stellt klar unter Beweis, dass die Migräne als eine primär neuronale Erkrankung klassifiziert werden muss. Weiter kann daraus abgeleitet werden, dass die Modulation von P/Q-Typ Kanälen ein vielversprechendes pharmakotherapeutisches Prinzip darstellt. Allerdings läßt sich diese Hypothese nicht direkt überprüfen, da derzeit keine Wirkstoffe mit hoher Bioverfügbarkeit im ZNS existieren, die selektiv die a1A Untereinheit der P/Q-Typ Kanäle modulieren. Daher haben wir in einem getrennten Teil dieses Forschungsprojekts untersucht, welche grundlegenden strukturellen Eigenschaften Pharmaka besitzen müßten, um an diese a1A Untereinheit zu binden. Wir untersuchten warum Pharmaka (sog. Kalziumantagonisten), welche andere (sog. L-Typ -) Kalziumkanäle mit hoher Affinität modulieren, nicht an a1A Untereinheiten binden. Wir konnten nachweisen, dass drei Aminosäuren der a1A Untereinheit eine solche Bindung verhindern, da sie entweder den Zugang zu einer möglichen Bindungsstelle blockieren bzw. nicht die erforderliche Kontaktstelle für diese Pharmaka zur Verfügung stellen können. Daraus läßt sich postulieren, dass kleine und hydrophobe Derivate existierender Kalziumantagonisten mit einer der Klasse der sog. Dihydropyridine verwandten Grundstruktur vielversprechende Ausgangspunkte für die Entwicklung P/Q-Typ- selektiver Kalziumkanalmodulatoren darstellen könnten. Diese Hypothese wird in künftigen Projekten überprüft werden. Sämtliche Ergebnisse wurden in hochwertigen internationalen Fachzeitschriften veröffentlicht. Sie stellen eine wichtige Grundlage für das Verständnis der Pathophysiologie der Migräne und der Entwicklung neuer Generationen von migränewirksamen Pharmaka dar.