Der Carboxyterminus der alpha1C Untereinheit des L-Typ Ca2+ Kanals

2+ Kanals Der Ca2+ Kanal des Herzmuskels spielt eine bedeutende Rolle bei der Herzfunktion. Über ihn einströmendes Ca2+ steuert die Muskelkontraktion. Das Verstehen von Regulationsmechanismen am Ca2+ Kanal erscheint demnach essentiell um regulativ (therapeutisch) eingriffen zu können. Mehrere Untereinheiten sind im Ca2+ Kanal assoziiert. Die Hauptuntereinheit stellt die alpha1 Untereinheit dar. In ihr sind strukturell alle wichtigen Eigenschaften wie Aktivierung, Permeation (Pore) und Inaktivierung lokalisiert. Der Carboxyterminus dieser alpha1 -Untereinheit könnte essentiell sowohl für die Aktivierung des Kanals als auch dessen Inaktivierung sein. Der Aktivitätszustand des Ca2+ Kanals wird einerseits durch Calpastatin und andererseits durch Ca2+ reguliert. Während Calpastatin den Kanal in einem aktiven Zustand hält, bewirkt Ca2+ eine Inaktivierung des Kanals. Ziel dieses Projektes ist es, den Carboxyterminus der alpha1c Untereinheit als Schlüsselstruktur in der Regulation des L-Typ Ca2+ Kanals durch Calpastatin und Ca2+ nachzuweisen. Zum einen soll gezeigt werden, daß die Kanalaktivität mit einer Interaktion von Calpastatin und dem Kanal korreliert ist, zum anderen soll untersucht werden, ob eine Inaktivierung des Kanals durch Ca2+ möglicherweise durch eine Störung dieser Interaktion vermittelt wird. Hiefür werden eine Reihe experimenteller Techniken eingesetzt. Die Patch- Clamp Technik wird benützt, um die Ca2+ Kanalaktivität von einzelnen Ionenkanälen in Abhängigkeit einer Interaktion mit Calpastatin zu detektieren. Diese Interaktion soll in der Folge mit neuen mikroskopischen Verfahren sichtbar gemacht werden. Einerseits wird hierfür eine hochauflösende Einzelmolekülspektroskopie und andererseits eine Kraftmikroskopie verwendet, beide Methoden , die kombiniert mit Patch-Clamp ermöglichen sollen, Kanalaktivität mit der Interaktion von Calpastatin zu korrelieren. Zusätzlich wird durch Verwendung von molekularbiologischen und biochemischen Methoden versucht, diese potentielle Interaktion auf in vitro Ebene mit Calpastatin und einem Stückchen des Varboxyterminus der alpha1c Untereinheit des Ca2+ Kanals nachzuweisen. Der postulierte Mechanismus für die Ca2+-induzierte Inaktivierung wird ebenfalls mit den erwähnten Techniken untersucht. Weiters ist die Untersuchung von alpha1c Untereinheiten mit Mutationen im Carboxyterminus geplant, um relevante Domänen für die Interaktion mit Calpastatin und Ca2+ zu lokalisieren. Der Nachweis einer Regulation des Ca2+ Kanals durch Calpastatin würde einen vollkommen neuen Weg zur zellulären Steuerung dieses weit verbreiteten Kanaltyps aufzeigen. Die Identifizierung einer direkten Wechselwirkung von Calpastatin mit dem Carboxyterminus der alpha1c Untereinheit sowie einer Lokalisierung dafür relevanter Domänen würde unser Wissen um Struktur-Funktions-Beziehungen am Ca2+ Kanal signifikant bereichern. Darüber hinaus wäre eine Involvierung dieses Regulationsmechanismus im Prozeß der Ca2+-induzierten Inaktivierung ein molekular einfacher und effektiver Weg zur Inaktivierung des Ca2+ Kanals.

Ziel dieses Projektes war es zelluläre Mechanismen der L-Typ Ca2+ Kanalregulation aufzuklären, methodisch unterstützt von Elektrophysiologie, Biochemie und Molekularbiologie sowie der Fluoreszenzmikroskopie. In Carboxyl-Terminus der alpha1C Untereinheit des Ca2+ Kanals konnte eine Aminosäurensequenz (aa 1572-1651) identifiziert werden, die als molekulare Determinante für das Targeting, die Leitfähigkeit, die Kinetik und den run- down des Ca2+ Kanals fungiert. Die Rolle des Calmodulin für den Prozeß der Ca2+-abhängigen Inaktivierung wurde auf Einzelkanalebene mit Hilfe einer Calmodulin Mutante, die nicht mehr Ca2+ binden kann, studiert. In diesem Zusammenhang wurde an der alpha1C Untereinheit jene Bindungsstelle identifiziert, die Calmodulin im Ruhezustand der Zelle bindet. Weiters konnten wir zeigen, dass die Aktivität des Ca2+ Kanals auch über das Protein Calpastatin in vivo reguliert wird. Ebenso wird das schnelle Gating des Kanals über Wechselwirkung mit der beta2a Hilfsuntereinheit beeinflusst. Zusätzlich kann das Gating über S-Nitrosierung des Kanals gesteuert werden. Mittels hochsensitiver Fluoreszenzmikroskopie gelang es einzelne Ca2+ Kanäle in vivo sichtbar zu machen.