Basenstapelung und Rahmenverschiebung in Oligonukleotiden

Das vorliegende Projekt beinhaltet Studien zur Basenstapelung in Oligoribonukleotiden unter dem speziellen, in der Biologie als Frameshifting bekannten Aspekt (Verschiebung des Leserahmens an der mRNA im Zuge der ribosomalen Proteinsynthese). Theoretische Überlegungen, die auf Erfahrungen des Antragsstellers von Basenstapelungstudien an alternativen Oligonukleotidsystemen basieren, legen nahe, daß die Optimierung der Basenstapelung eine grundlegende funktionelle Determinante im Prozeß des Frameshiftings darstellt. Der Schlüssel zum Verständnis auf welche Art und Weise diese Optimierung passiert, liegt in der Differenzierung von INTRA und INTERstrang Basenstapelung. Im speziellen ist die Synthese von kurzen RNA-Oligonukleotiden geplant, die natürliche programmierte `frameshift sites` beinhalten. Die Bestimmung der thermodynamischen Parameter ihrer Duplexbildung soll die Analyse der Daten im Hinblick auf Basenpaarung und Basenstapelung im codierten und re-codierten Anticodon-Codon Modellpaarungskomplex ermöglichen. Es wird angenommen, daß zumindest im Falle von programmierten +1 `Frameshift` Sequenzen das thermodynamische Gleichgewicht der Anticodon-Codon Paarung in Richtung re- codierten Paarungskomplex verschoben wird, und zwar durch die Optimierung der Basenstapelung. In diesem Zusammenhang sollen auch Nukleotide für die Festphasensynthese dargestellt werden, die ein erweitertes p -Elektronensystem aufweisen. Die Modifikationen sind so ausgelegt, daß Basenstapelungskräfte erhöht werden, während das ursprüngliche Wasserstoffbrückenbindungsmuster weitgehend unbeeinflußt bleibt. Der Einbau dieser Basen in RNA- und DNA-Oligonukleotidduplexe soll ihre thermodynamische Stabilität erhöhen und sie speziell in der Analyse von Frameshift Sequenzen einsetzbar machen. Über die weiterreichende Bedeutung von Studien dieser Art zeugt unter anderem ein kürzlich in Science erschienener Artikel, der die Entdeckung von Frameshift-Mutanten im Zuge der Alzheimer und Down Krankheit beschreibt (Science 1998, 279, 242-247).

Die Haupterrungenschaft dieses Projekts besteht in der Entwicklung eines neuen Modells für die Codon- Anticodonpaarung. Die Charakteristik des Modells ist die kovalente cyclische Verbrückung zweier kurzer Oligonukleotide - der Anticodon- und der Codonsequenz - mit geeigneten flexiblen Kohlenstoffketten. Daraus resultiert eine hohe Stabilisierung, die die Bestimmung der thermodynamischen Paarungsparameter für die Doppelhelixbildung sehr kurzer RNA-Duplexe ermöglicht. Im Hinblick auf die Codon-Anticodonpaarung kann damit der Einfluss strukturrelevanter benachbarter Nukleotide einfach quantifiziert werden. Das chemisch orientierte Projekt behandelte ein Gebiet der RNA Biologie von grosser Bedeutung, nämlich der ribosomalen Translation. Im speziellen, war ein Beitrag zum tieferen Verständnis der molekularen Details der tRNA/mRNA Decodierung unter dem besonderen Aspekt ribosomaler Lesefehler beabsichtigt und ist umgesetzt worden. Derartige Untersuchungen sind von allgemeiner Bedeutung, da für unterschiedliche Krankheitsbilder (z.B. Alzheimer- und Downsyndrom) Mutanten, die auf sogenannte Leserahmenverschiebungen zurückzuführen sind, nachgewiesen wurden. Wir haben nun chemische Modellverbindungen für die Codon-Anticodonpaarung entworfen und realisiert. Diese Modelle bestehen aus zwei komplementären Tripletsequenzen (Codon und Anticodon) gemeinsam mit einzelnen Nukleotidüberhängen an den 3`-Enden. Diese ungepaarten Nukleotide sind strukturell relevant für die Codon- Anticodonpaarung, da sie mit dem eigentlichen Paarungskomplex interagieren können und eine signifikante Stabilisierung durch Basenstapelung bewirken. Die Stärke unseres Modells ist, dass der thermodynamische Einfluss dieser Nukleotide mit einfachen Methoden quantifiziert werden kann. In diesem Sinne ist unser Modell eine wesentliche Errungenschaft und einzigartig in seiner Art. Bisher bestand der einzige Zugang zu derartigen Daten über ein alternatives, aufwendigeres Modell von H. Grosjean, dass auf den Effekt der tRNA Dimerisierung (die nur für tRNAs mit komplementären Anticodonsequenzen beobachtbar ist), beruhte. Ein weiterer wesentlicher Grundstein für den Projekterfolg war die von uns entwickelte Synthesestrategie der cyclischen Modellverbindungen. Es handelt sich dabei um eine breit anwendbare Festphasencyclisierung mit der jede beliebige cyclische RNA-Sequenz mit einer Länge von 2 bis ca. 20 Nukleotiden zugängig ist. Die biologische Bedeutung kurzer RNA-Cyclen ist vielfach in der Literatur belegt. Eine weiter Entwicklung unserer Forschung ergab sich aus der Tatsache, das die Nukleotide benachbart zur Anticodonsequenz in den meisten Fällen chemisch modifiziert sind. Wir haben uns vorerst der Untergruppe von methylierten Nukleosiden zugewandt und sind der Frage nach ihrem Einfluss auf die RNA Sekundär- und Tertiärstruktur nachgegangen. Allgemein wird den Modifikationen nur ein modulierender Einfluss zuerkannt. In einer umfassenden Studie fanden wir jedoch, dass methylierte Nukleotide entscheidend für die Ausbildung der Sekundärstrukur sein können und weiters, dass Methylierungen auch das Umorganisieren einer komplexen RNA- Faltung induzieren können mit, die mit Basenpaarbrüchen eines gesamten doppelhelikalen Bereichs einhergehen kann.