Strukturbestimmung von B12 Enzymen

Gegenstand des Projekts ist die Ermittlung hochaufgelöster 3D Strukturen von Enzymen mit einem B12 Kofaktor. Dies soll zu einer atomaren Definition der einzelnen Schritte führen, welche im aktiven Zentrum von Koenzym B12 abhängigen Enzymen während eines katalytischen Zyklus ablaufen. lm einzelnen sollen die Enzyme Glutamatmutase und Methylenglutaratmutase (beide aus Clostridium Cochlearium) sowie ein corrinoides Protein aus Sporomusa Ovata untersucht werden. Als Technik zur Strukturbestimmung wird die makromolekulare Röntgenkristallographie eingesetzt werden, gezielte Fragestellungen betreffend die Metallkoordination des Kofaktors sollen mittels Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS) untersucht werden. Spektroskopische (UV/VIS, Fluoreszenz und CD Spektrometrie) und biokalorimetrische (DSC, ITC) Techniken sollen Fragen betreffend Enzym-Enzym, Enzym-Kofaktor, Enzym-Substrat und Enzym-Inhibitor Wechselwirkungen zu klären und damit die Grundlage für nachfolgende proteinkristallographische Untersuchungen liefern. Als erstes Ziel ist die Bestimmung der 3D Strukturen für die nativen Enzyme geplant. Im Fall der Glutamatmutase schließt dies die Bestimmung der Strukturen der getrennten Untereinheiten ein. Hierauf sind Studien an Kristallen mit gebundenem Inhibitor und mit synthetisch modifizierten Koenzymen (z.B. Didesoxyadenosylcobalamin) geplant, um den Mechanismus der Koenzymaktivierung (Co-C Bindungshomolyse) als ersten kritischen Schritt des Reaktionszyklus aufzuklären. Sobald Information über den Aufbau aktiver Zentren verfügbar ist, wird die kristallographische Untersuchung von Punktmutanten Licht in die strukturelle und funktionelle Rolle einzelner Aminosäuren bringen. Ein Röntgenabsorptions-Experiment zur Bestimmung der Koordinationsgeometrie im enzymgebundenen B12 Kofaktor soll die Frage einer enzym-induzierten Verlängerung der axialen Kobalt- Stickstoffbindung klären. Alle Untersuchungen werden im Rahmen einer interdisziplinären transnationalen Zusammenarbeit zwischen 8 europäischen Laboratorien durchgeführt werden, welche in Summe die weltweit auf dem B12-Gebiet führende Gruppierung darstellt. Ihre 8 Teilnehmer sind formell durch ein TMR-Netzwerk zum Thema "Chemistry and Biochemistry of B12 Coenzymes and Their Enzymic Partners" verbunden. Innerhalb dieses Netzwerks hat das Laboratorium der Antragsteller die Aufgabe der Strukturbestimmung von B12-abhängigen Enzymen und Proteinfragmenten mittels Röntgenkristallstrukturanalyse übernommen.

Die B12-Koenzyme sind die komplexesten nicht-polymeren Naturstoffe. Sie enthalten die einzige Metall- Kohlenstoffbindung die man bisher in der Natur gefunden hat. B12-Koenzyme sind Kofaktoren für ca. 10 Enzyme, welche chemische Reaktionen ohne Präzedent in der organischen Chemie katalysieren. Adenosylcobalamin- abhängige Enzyme katalysieren Radikalreaktionen, deren erster Schritt in einer homolytischen Spaltung der organometallischen Bindung des Kofaktors besteht. Die Art und Weise wie diese Enzyme die Homolyserate durch Substratbindung um ca. 12 Zehnerpotenzen erhöhen, und wie sie die nachfolgenden Umlagerungsschritte via instabile und hochreaktive Intermediate kontrollieren, hat seit vielen Jahren Chemiker und Biologen fasziniert. Das Ziel des vorliegenden Projekts war es, die 3D Struktur von Enzymen mit einem B12-Kofaktor sowie für isolierte B12 Kofaktor-Analoge experimentell zu bestimmen. Diese Information sollte zu einer atomaren Beschreibung der einzelnen Schritte, welche im aktiven Zentrum Koenzym-B12 abhängiger Enzyme ablaufen, führen. Das Enzym, auf das wir unser Interesse konzentrierten, war die Glutamatmutase, welche die Gleichgewichtseinstellung zwischen (S)-Glutamat und (2S,3S)-3-Methylaspartat katalysiert. Der wichtigste Erfolg unseres Projekts war die kristallographische Strukturbestimmung der Glutamatmutase aus Clostridium cochlearium. Die 3D Struktur ermöglichte die direkte Beobachtung der Bindung eines Substrat- Analogen an den Enzym-Koenzym-Komplex. Aufgrund dieser Struktur konnte der sogenannte Fragmentierungs - Rekombinations - mechanismus für die von Glutamatmutase katalysierte Umlagerungsreaktion bestätigt werden. Die 3D-Struktur des Komplexes zwischen Adenosylcobalamin und apo-Glutamat zeigte überdies, wie das intermediär gebildete hochreaktive Adenosylradikal vom B12 Kofaktor zum Substrat transportiert wird. Mittels Röntgenabsorptions-Spektroskopie konnten wir zeigen, dass die Homolyse der organometallischen Bindung nicht signifikant beeinflußt wird durch eine Enzym-induzierte Verlängeruzng der trans-axialen Kobalt- Stickstoffbindung, und dass die kristallographische Beobachtung einer derartigen Bindungsverlängerung im Enzym Methylmalonyl-CoA-Mutase aller Wahrscheinlichkeit nach ein Artefakt der kristallographischen Technik ist. Alle diese experimentellen Resultate stellen wesentliche Beiträge zum Verständnis Koenzym-B12-abhängiger Reaktionen dar. Die Arbeiten wurden in enger Zusammenarbeit mit Partnern aus Österreich, Deutschland, der Schweiz und England im Rahmen eines von der EU geförderten Netzwerks über "chemistry and biochemistry of B12 coenzymes and their enzymic partners" durchgeführt.