µ-Fließinjektions-TR-S2-FT-IR Spektroskopie

Das Ziel des hier beantragten Forschungsprojekt ist die Entwicklung neuer analytischer Methoden zur zeitaufgelösten Untersuchung von raschen chemischen Reaktionen in Lösung mittels FT-IR-Spektroskopie. Die geplanten Methoden werden Informationen über den dynamischen Reaktionsverlauf auf molekularer Ebene direkt verfügbar machen und universell einsetzbar sein. Da solche Informationen mit herkömmlichen Methoden nicht zugänglich sind, ist ein erfolgreicher Einsatz der neuen Methoden in verschiedenen Forschungsrichtungen zu erwarten. Die geplanten Entwicklungen sind eine Weiterführung der im Forschungsprojekt m -FIA-FTIR-Systems (11338) erfolgreich durchgeführten Arbeiten und basieren auf der Kombination von modernen Techniken der zeitaufgelösten FTIR-Spektroskopie mit miniaturisierten Fließinjektionssystemen. Dadurch können die jeweiligen Vorteile der hohen Zeitauflösung zum einen und der hochpräzisen Flüssigkeitsmanipulation zum anderen in idealer Weise kombiniert werden. Die so konzipierten Analysesysteme werden besonders auch für irreversible Reaktionen anwendbar sein und eine Zeitauflösung bis in den sub-Millisekunden-Bereich erreichen. Im Rahmen des Projektes sollen zwei Arbeitspakete verwirklicht werden: Zeitaufgelöste FT-IR-Spektroskopie von 1) chemischen Reaktionen in Lösung und 2) von Konformationsänderungen und Bioligand-Wechselwirkungen immobilisierter Biomoleküle. ad 1) Das Ziel dieses Arbeitspaketes ist es erstmals die step-scan FT-IR Technik zur zeitaufgelösten Untersuchung von raschen chemischen Reaktionen in Lösung anwendbar zu machen. Dazu werden neue, leicht triggerbare miniaturisierte, Fließsysteme zum schnellen Mischen von kleinen Flüssigkeitsmengen entwickelt werden. Die Aufgabe der Fließsysteme ist die zu untersuchende Reaktion rasch, reproduzierbar und beliebig oft auszulösen, um so die Voraussetzung zur Anwendung der step-scan Technik zur FT-IR Spektrenaufnahme zu schaffen. Geplante Anwendungen liegen in der Katalysatorentwicklung zur Charakterisierung von kurzlebigen Zwischenprodukten, sowie in der biochemischen Grundlagenforschung z.B. bei der Untersuchung der Proteinfaltung. ad 2) Der Schwerpunkt dieses Arbeitspaketes liegt in der Entwicklung einer neuen Methode zur Untersuchung von Konformationsänderungen immobilisierter Biomoleküle sowie in der erstmaligen Erfassung von Bioligand- Wechselwirkungen auf molekülspezifischer Ebene. Während bei bisherigen IR-spektroskopischen Untersuchungen Biomoleküle auf ATR-Oberflächen immobilisiert wurden, wird hier ein neuer, flexiblerer Ansatz verfolgt werden: Die zu untersuchenden Biomoleküle werden auf kleinen Mikrokügelchen (micro-beads) immobilisiert, wodurch wegen der hohen inneren Oberfläche eine große Belegung mit Biomolekülen erzielt werden kann. Zusätzlich lassen sich diese Kügelchen mit einem Fließsystem präzise bewegen und auch temporär am Ort der Messung, z.B. einer faseroptischen Transmissionszelle festhalten. Dadurch wird es möglich die Biomoleküle kurzen Pulsen verschiedener Reagentien auszusetzen und die dadurch hervorgerufenen spektralen Änderungen im MIR-Bereich direkt zu verfolgen. Für Wiederholmessungen sowie zur Untersuchung von irreversiblen Reaktionen können die verbrauchten Biomoleküle durch Austausch der Kügelchen leicht durch neue ersetzt werden. Geplante Anwendungen dieser Methode sind u.a. die Untersuchung von Enzyminhibierungen sowie die molekülspezifische Messung von Antigen-Antikörper Wechselwirkungen. Zur Erreichung der Projektziele werden bestehende nationale sowie internationale Kooperationen fortgeführt bzw. erweitert, um so bereits vorhandenes Know-how optimal nutzen zu können.

Im Rahmen dieses Projektes wurden miniaturisierte Analysensysteme für die zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie entwickelt. Diese Systeme sind in der Lage beliebige chemische Reaktionen in Lösung auszulösen und mit einer Zeitauflösung im unteren Millisekundenbereich direkt zu beobachten. Zu diesem Zweck wurde eine Mikrostruktur bestehend aus strukturiertem SU-8 Polymer sowie einer Silberschichte in eine für infrarotes Licht durchlässige Mikrodurchflusszelle integriert. Die kleinen Distanzen im IR-Mischer erlauben rasches diffusionskontrolliertes Mischen und gleichzeitige Beobachtung im infraroten Spektralbereich. Aufgrund der direkten molekülspezifischen Informationen welche im infraroten Spektralbereich enthalten sind können die ablaufenden Reaktionen direkt beobachtet werden. So kann etwa das Entstehen von Zwischenprodukten sowie die Bildung von Wasserstoffbrücken erkannt werden. Aufgrund seiner Miniaturisierung benötigt das entwickelte System nur geringste Probenmengen was gerade bei der Untersuchung von biochemischen Systemen sehr vorteilhaft ist. Im Rahmen des Projektes wurde etwa die Reaktion von dem Antibiotikum Vancomycin mit einem Tri-peptid untersucht. Es konnte so erstmals ein experimenteller Nachweis für einen zweistufigen Bindungsmechanismus erbracht sowie das nach rund 200 ms entstandene Zwischenprodukt charakterisiert werden. In ähnlicher Weise können nun auch andere bio-chemische Systeme mit dieser Technik untersucht werden. Um ein Maximum an Information aus den gewonnenen Datensätzen zu gewinnen wurden auch mathematische Methoden zur Auswertung der Spektren untersucht und weiterentwickelt. Es ist nun möglich die Anzahl der bei einer Reaktion beteiligten unterschiedlichen Verbindungen zu bestimmen sowie ihr Spektrum und ihren Konzentrationsverlauf über die Zeit zu ermitteln. In einem weiteren Teil des Projektes gelang es die Kapillar-elektrophorese, eine sehr leistungsfähige analytisch- chemische Trennmethode erstmals kontinuierlich mit der Infrarotspektroskopie zu verknüpfen. Diese neue Kopplung erlaubt nun Substanzmischungen rasch zu trennen und die einzelnen Analyten on-line, IR spektroskopisch zu untersuchen. So können z.B Proteine getrennt und ihre Sekundärstruktur bestimmt werden.