Protein C Inhibitor Gen knockout in Mäusen

Protein C Inhibitor (PCI) ist ein Serinprotease Inhibitor, der mit einer Reihe von plasmatischen und extravaskulären Serinproteasen stabile enzymatisch inaktive 1:1 Komplexe bildet. Zu den Serinproteasen, welche von PCI gehemmt werden, gehören die antikoagulatorische Protease aktiviertes Protein C, die Gerinnungsfaktoren Faktor Xa, XIa, Plasmakallikrein, Thrombin, die Plasminogenaktivatoren Urokinase und Gewebeplasminogenaktivator, aber auch Trypsin-ähnliche extravaskuläre Proteasen, wie Gewebekallikrein, Prostata spezifisches Antigen und Acrosin. Da bis jetzt die physiologische Bedeutung des PCI noch nicht geklärt ist, sollen im vorliegenden Projekt die Auswirkungen eines knockouts des PC Genes untersucht werden. Es wurde ein targeting vector, pPNT.PCI , bestehend aus 9.2 kb homologer Sequenzen des Maus-PCI Gens, einem positiven Selektionsmarker (Neomycin-Resistenz Gen) und einem negativen Selektionsmarker (Thymidinkinase Gen) konstruiert. Electroporation der embryonalen Stammzellen mit dem linearisierten pPNT.PCI Vector ergab fünf "targeted clones" (gezielte Klone) mit richtiger homologer Rekombination am 5` und 3` Ende, was durch Southern Blot Analyse mit gereinigter DNA und mit geeigneten Restriktionsenzyme und Proben bestätigt wurde. Diese "targeted clones" wurden zur Herstellung von PCI defizienten Mäusen verwendet. Zwei chimäre Mäuse (eins männlich, eins weiblich) mit Chimärismus zwischen 60-80 % wurden geboren und auch schon gepaart, um heterozygote (PC+/-) transgene Mäuse zu bekommen. Heterozygote f 1 -Tiere werden gekreuzt, um homozygot-transgene Tiere (PCI-/-) zu erhalten. Homozygote Mäuse werden auf die Anwesenheit des "targeted" Gens durch Southern Hybridisierung getestet, dabei wird DNA aus einem Schwanzstück verwendet. Gewebeextrakte homozygoter Nachkommen der f l-Generation werden mittels Northern und Western Blotting untersucht, um die Höhe von PCI mRNA bzw. Protein zu bestimmen. Die Lebensdauer, das Körpergewicht 5 Wochen alter Tiere und die Häufigkeit der Würfe bei homozygoten Tieren soll mit denjenigen des Wildtyps verglichen werden. Die transgenen Tiere werden einerseits hinsichtlich des Auftretens von Gewebeschädigungen und andererseits hinsichtlich. von Veränderungen im hämostatischen System, im Kallikrein-Kinin System, im Fortpflanzungssystem, sowie im Hormontransport untersucht. Aufgrund der erwarteten wichtigen Rolle von PCI bei der Hemmung der Aktivitäten der Serinproteasen sollte eine erfolgreiche Durchführung dieses Projekts neue Erkenntnisse über die biologische Funktion des PCI liefern.

Protein C Inhibitor (PCI) ist ein unspezifischer, Heparin-bindender Serine Protease Inhibitor (Serpin), der mit einer Reihe von plasmatischen und extravaskulären Serinproteasen enzymatisch inaktive, stabile 1:1-Komplexe bildet. PCI hemmt aktiviertes Protein C (APC), die Plasminogenaktivatoren Urokinase (uPA) und Gewebeplasminogenaktivator (tPA), und die Spermienprotease Acrosin. Humaner PCI ist ein Plasma Protein, kommt aber auch in anderen Organen, insbesondere im Reproduktionstrakt vor. Die Co-Lokalisation von hohen PCI-Konzentrationen mit einigen seiner Zielproteasen in männlichen Reproduktionsorganen deuten auf eine Rolle von PCI in der Reproduktion hin. Im Rahmen eines vorherigen FWF-Projektes (P13452) haben wir transgene Mäuse mit fehlenden PCI etabliert (PCI -/- Mäuse). Die PCI-/- Mäuse waren offenbar gesund, aber die männlichen Mäuse waren unfruchtbar. Die Sertoli-Zell-Barriere in diesen Mäusen war zerstört and die Spermatogenese war abnormal. Die resultierenden Spermien waren missgebildet und morphologisch ähnlich wie die abnormalen Spermien in manchen Fällen von humaner männlicher Infertilität. Im Rahmen des vorgeschlagenes Projekts möchten wir die Ursachen dieser Infertilität weiter klären. Zur Untersuchung der Möglichkeit, dass die bemerkten Veränderungen in den PCI-/- Mäusen durch die ungehemmte proteolytische Aktivität verursacht wurden, sollen im vorliegenden Projekt die transgenen Doppel-knockout Mäuse (PCI und jeweils eine Ziel-Protease, z.B. uPA, tPA oder Akrosin) etabliert werden. Diese Mäuse werden hinsichtlich Fertilität analysiert und die Organe des Reproduktionstraktes werden bezüglich der Morphologie und der proteolytischen Aktivität untersucht. Zusätzlich wird die genaue Lokalisierung von PCI in männlichen Reproduktionsorganen der Wild-Typ-Tiere immunohistochemisch untersucht. Zieht man eine Zerstörung der Blut-Hoden-Schranke von PCI-knockout Mäusen in Betracht, so sollten männliche PCI-knockout Mäuse auf An- oder Abwesenheit von Anti-Spermien Antikörpern untersucht werden. Zusätzlich werden weitere Formen von PCI (aktiv, gespalten, mit Proteasen Komplexe bildend) in den Hoden analysiert werden. Eine Analyse der Interaktion von Keimzellen mit Sertoli Zellen ex vivo sollte durchgeführt werden, um den Mechanismus, der für die Zerstörung der Sertoli-Zell-Barriere und die Zerstörung der Sertoli-Zell-Keimzell-Verbindung in PCI-knockout Mäusen verantwortlich ist, zu analysieren. Eine erfolgreiche Durchführung dieses Projekts sollte neue Erkenntnisse über den Mechanismus der männlichen Infertilität im Zusammenhang mit PCI-Mangel liefern. Wir glauben, dass das Ergebnis dieser Studie für eine weitere Analyse der molekularen Grundlagen menschlicher Infertilität einer beträchtlichen Population infertiler Patienten in der Zukunft relevant sein könnte.