NMR Spektroskopie von Biomolekülen

Das CRP2 Protein gehört zur Familie der zinkbindenden Proteine ("Zinkfinger-Protein") und besteht aus zwei sogenannten LIM Domänen, definierte strukturelle Einheiten mit konservierten zink-koordinierenden Aminosäuren. Es wurde vor einigen Jahren durch eine biochemische Technik entdeckt, die selektiv jene Gene (bzw. deren Expressionsprodukte) in Zellen identifiziert, die durch Onkogene oder chemische Karzinogene transformiert wurden, und ist daher ein essentieller Faktor der koordinierten Zellteilung bzw. Zelldifferenzierung. Jede einzelne LIM Domäne besteht aus zwei orthogonal angeordneten b -Faltblättern, deren relative Orientierung durch die Wechselwirkung konservierter hydrophober Aminosäuren im Inneren teilweise bestimmt wird und eine vermutlich auch funktionell wichtige Determinante der beiden Domänen darstellt. Die Tertiärstruktur der beiden LIM Domänen bleibt im Gesamtprotein erhalten. Zusätzlich ergab eine detaillierte Relaxationsuntersuchung, daß die Reorientierung der beiden LIM Domänen im Gesamtprotein unkorreliert erfolgt, also keine bevorzugte relative Orientierung der beiden LIM Domänen vorliegt. Im beantragten Forschungsprojekt soll nun versucht werden, die Lösungsstruktur des Gesamtproteins weiter zu verfeinern. Insbesondere soll versucht werden, den Rotationsdiffusionstensor des Moleküls (mit anderen Worten die "Form" des Proteins) in Lösung zu bestimmen. Dies wäre von erheblichem Nutzen auch für die später geplanten NMR-Untersuchungen an einem CRP2-Komplex: mit dem physiologisch relevanten Bindungspartnern. Weiters sollen Strukturuntersuchungen an CRP2-Mutanten dazu dienen, die strukturverantwortlichen interatomaren Wechselwirkungen von CRP2 zu charakterisieren. Vorläufige NMR-Messungen ergaben experimentelle Hinweise auf eine Homodimerisierung der carboxyl-terminalen LIM2 Domänen von CRP2. Eine strukturelle Charakterisierung des CRP2-Dimers in Lösung soll daher verwendet werden, um wertvolle Informationen in bezug auf die Proteinerkennungsmöglichkeiten von CRP2 zu liefern. Die in paramagnetischen CRP2-Derivaten (Ersatz von diamagnetischem Zink durch das paramagnetische Cobalt (II)) auftretenden Kern-Elektron Wechselwirkungen sollen durch neuartige NMR-Experimente quantifiziert und als zusätzliche experimentelle Parameter zur Strukturbestimmung verwendet werden. Im methodisch orientierten Teil des Forschungsprojektes sollen neue NMR-Experimente zur Struktur- und Dynamikbestimmung in Proteinen entwickelt werden. Ziel ist es einerseits, Korrelationen zwischen unterschiedlichen Relaxationsmechanismen von Kernen des Proteinrückgrats ("backbond") zu quantifizieren und daraus Informationen über die Lage der jeweiligen Peptidebene im Achsensystem des Rotationsdiffusionstensors zu gewinnen. Um eine möglichst große Dispersion der Projektionen der einzelnen Peptidebenen zu gewährleisten, soll ein kürzlich erarbeitetes heteronulkleares Relaxationsexperiment mit heteronuklearen Korrelationsexperimenten kombiniert werden. Dies gewährleistet die notwendige spektrale Auf1ösung, um eine ausreichende Anzahl von Backbone-Atomen zu untersuchen. In weiterer Folge soll diese zusätzliche Information für Strukturverfeinerungen verwendet werden. Es soll insbesondere der Frage nachgegangen werden, inwieweit diese zusätzlichen "long- range" Informationen (d.h. Informationen über die relative Anordnung von räumlich weit voneinander getrennten Strukturelementen) die Genauigkeit der resultierenden NMR Strukturen verbessern können.