EWS-FLI1 Inhibitoren

Forschungsprojekt P 13708EWS-FLI1 InhibitorenHeinrich KOVAR28.06.1999 Die Familie der Ewing Tumoren (EFT) ist durch ein Rearrangement des EWS Gens mit einem ets Onkogen gekennzeichnet. In der Folge entsteht ein chimäres Protein, welches zur Regulation von bislang unbekannten Zielgenen befähigt ist, und dessen Anwesenheit sowohl für das Wachsturn wie für die Tumorigenität von EFT Zellen absolut notwendig ist. In einem vorangegangenen durch den FWF unterstützten Projekt konnten wir die Interaktion des N-terminalen EWS Teiles des chimären Proteins mit einem generellen Transkriptionsfaktor, hsRPB7, beweisen. Diese Interaktion war vom Vorhandensein der C-terminalen ets Domöne bzw. vom Fehlen des entsprechenden C-terminalen Abschnittes von EWS, wie es in den EFT assoziierten Fusionsproteinen der Fall ist, abhängig. Dies bedeutet, daß zwar EWS-ets, nicht aber normales EWS zur Interaktion mit hsRPB7 begfähigt ist, obwohl die N-terminale EWS Domäne in beiden Proteinen enthalten ist. Es scheint also, daß es in Folge der Proteinfusion zu einer generellen Strukturänderung im EFT assoziierten Onkoprotein kommt, welche die N- terminale EWS Domäne für die Interaktion mit hsRPB7 und möglicherweise anderen zellulären Proteinen zugänglich macht. Ziel des vorgelegten Projektantrages ist es nun, Agenzien herzustellen, welche diese Proteininteraktion blockieren und damit das Wachstumsverhalten von EFT negativ beeinflussen können. Zunächst werden die Proteininteraktionsdomänen auf EWS und hsRPB7 auf wenige Aminosäuren eingegrenzt. Auf Grund dieser Information sollen nun kurze, durch Kopplung an Penetratin zellpermeable, Peptide hergestellt werden, welche um die Bindung an den jeweiligen Interaktionspartner kompetieren können. Diese Reagenzien sollen den Wachstumsmedien von EFT und nicht-EFT Zellen beigemengt werden und. deren Spezifität und Wachstumsinhibierende Eigenschaften geprüft werden. Gleichzeitig soll jenes EWS-Peptid, welches der hsRPB7 Interaktionsdomäne entspricht, zur Herstellung eines monospezifischen, monoklonalen Antikörpers (mAb) eingesetz werden. In der Folge sollen die für die variablen Regionen der leichten und schweren Ketten des Antikörpers kodierenden Gensquenzen aus cDNA der entsprechenden Hybridomzellinie kloniert und mit Hilfe eines artifiziellen Verbindungsgliedes ein rekombinanter "single chain" Antikörper (sFv) hergestellt werden. MAb und sFv werden auf ihre Spezifität für das EWS-ets Fusionsprotein getestet werden. Da bisher keine Tumor- spezifischen immunologischen Reagenzien für EFT existieren, könnten sich unsere Antikörper als wichtiges diagnostisches Hilfsmittel erweisen. Der sFv soll dann zur intrazellulären Expression, gekoppelt an ein Kernlokalisationsmotiv und ein Green Fluorescent Protein in einen geeigneten Expressionsvektor eingesetzt werden, um die EWS Interaktionsdomäne intrazellulär zu blockieren (Intrabody). Für beide Ansätze, zellpermeables Peptid und Intrabody sollen die physiologischen Auswirkungen zunächst an Zellinien, bei Erfolg später auch in Kollaboration in einem in-vivo Modell (EFT-transplantierte SCID Mäuse) genau beschrieben. werden. Diese Untersuchen können einen ersten Schritt in Richtung innovativer biologischer Behandlungsstrategien für EFT darstellen.

Wir haben in-vitro Einzelkettenantikörper gegen ein tumorspezifisches Onkoprotein hergestellt, welche in den Tumorzellen exprimiert werden können, um mit der onkogenen Funktion des Zielproteins zu interferieren. Tumor assoziierte chromosomale Umlagerungen bei Ewing Tumoren (EFT) fusionieren einen Teil des EWS mit einem von 5 ets Genen (FLI1, ERG, ETV, FEV und E1AF), welche für Transkriptionsfaktoren kodieren. EWS-ETS Fusionsprodukte spielen eine dominante Rolle in der Onkogenese von EFT. Es sollten spezifische Inhibitoren für den onkogenen Transkriptionsfaktor EWS-FLI1, welcher als Folge einer Translokation zwischen den Chromosomen 11 und 22 in 85% aller EFT entsteht, konstruiert werden. Diese Agenzien sollten sich gegen eine spezifische Region von EWS-FLI1 richten und mit Proteinwechselwirkungen an dieser Stelle interferieren. Das Projekt basierte auf der unterschiedlichen Fähigkeit von EWS-FLI1 und EWS mit der RNA Polymerase Untereinheit hsRPB7 zu interagieren, obwohl die beteiligte Proteindomäne in beiden Genprodukten vorhanden ist. Wir nahmen daher an, dass ein Epitop, welches im Zusammenhang des normalen EWS nicht exponiert ist, als Folge der Genfusion mit FLI1 für Proteinwechselwirkungen zugänglich wird. Wir haben die minimale Interaktionsregion von EWS-FLI1 mit hsRPB7 genau eingegrenzt. Es sollten mit dieser Region kompetierende Peptide und intrazelluläre Einzelkettenantikörper als zwei alternative Methoden zur Ausschaltung der EWS-FLI1 Aktivität hergestellt werden. Der Ansatz mit den zellpermeablen Peptiden war nicht erfolgreich, da es uns nicht gelang, einen robusten physischen in-vitro Test für die EWS-FLI1 / hsRPB7 Interaktion auf Grund der nur schwachen Bindung zu etablieren. Unter Verwendung von synthetischen Bakteriophagenbibliotheken, welche rekombinante Antikörper an ihrer Oberfläche tragen, konnten wir jedoch mehrere Einzelkettenantikörper gegen EWS-FLI1 herstellen. Jene Klone, welche im immunologischen Test die höchste Reaktivität aufwiesen, banden spezifisch an rekombinantes EWS-FLI1, jedoch konnte bisher noch keine in-vitro Reaktivität mit endogenem EWS-FLI1 nachgewiesen werden. Laufende Untersuchungen sollen klären, ob diese Moleküle in-vivo mit EWS- FLI1 reagieren. Unsere Proteininteraktionsuntersuchungen im Laufe dieses Projektes identifizierten nicht nur einen neuen Interaktionspartner für EWS-FLI1, den Tumorsuppressor BARD1, sondern auch das Potential von EWS und EWS-FLI1 zu oligomerisieren. Wir haben Hinweise erhalten, dass Proteinmodifikationen das Potenzial zur Interaktion mit sich selbst und möglicherweise auch mit anderen Proteinen inklusive den hier generierten Einzelkettenantikörpern regulieren. Zukünftige Studien werden sich daher mit der Charakterisierung dieser Modifikationen und deren Regulation beschäftigen.