Fructose-2,6-Bisphosphatase - eine NMR-Studie

Das Ziel des vorgeschlagenen Projektes ist es die dynamischen und strukturellen Eigenschaften eines Enzyms mit Hilfe der NMR-Spektroskopie zu studieren und neue Methoden für die Untersuchung zu entwickeln. Bei dem zu untersuchenden Enzymkomplex ( ein Protein mit zwei funktionellen Seiten ) handelt es sich um die Fructose-2,6-bisphosphatase. Dieses Protein ist für die Regelung des Glucose Stoffwechsels wichtig, wobei die zwei metabolischen Reaktionswege die durch den hepatischen Enzymkomplex 6-Phospho-fructo-2- kinase/Fructose-2,6-bisphosphate (6-PF-2-K/Fru-2,6-P2 ) geregelt werden, einerseits die Kontrolle der Energiespeicherung und andererseits die Kontrolle des Blut-Glucose Spiegels in Säugerzellen, sind. Aus diesem Grund wurde diesem Protein eine entscheidende Funktion im Schaltschema zwischen Glycolyse und Glyconeogenese in der Leber zugewiesen. Die Einstellung der zelluläre Konzentration von Fru-2,6-P2 wird über die Hormone Glucagon und Insulin durch Phosphorilierung und Dephosphorilierung des Enzyms 6- Phosphofructo2-kinase/Fructose-2,6-bisphosphat ase (6-PF-2-K/Fru-2,6-P2 ) gesteuert. Ein noch besseres molekulares Verständnis dieser Funktion (Inhibierung, Stimmulierung) könnte möglicherweise wesentliche therapeutische Konsequenzen in der Behandlung der Diabetes nach sich ziehen. Nach einer vollständigen Zuordnung der vorhandenen NMR-Signale und der Erstellung einer Tetriär-Struktur - welche die Voraussetzung für alle weiteren Studien ist - sollen vor allem folgende überwiegend kinetische Eigenschaften der Fructose-2,6-bisphosphatase studiert werden: Protein-Protein Wechselwirkung; Proton Austauschraten; Protein Wassermolekül Bindungen. Diese Untersuchungen werden neben den Standardverfahren teilweise durch selektive NMR Experimente erfolgen wobei wir unter anderem von uns neue entwickelte selektive und nicht-selektive HEHAHA Techniken verwenden werden. Die von uns verwendeten Methoden sind besonders ausgewählt um die Sensitivität des Kohärenz-Transfers zu erhöhen und die Spektren, durch eine neu entwickelte Anregungstechnik zu vereinfachen.

Das bifunktionale Enzym 6-Phosphofructo-2-kinase/Fructose-2,6-bisphosphatase stellt ein Enzymsystem dar, welches in der Leber zwischen den Prozessen der Glycolyse und Glyconeogenese auswählt. Die Regulationsfähigkeit dieses Systems zu erforschen ist von grundlegender Bedeutung, vor allem deswegen, weil sich gezeigt hat, dass man über die regulatorische Kraft dieses Systems eine signifikante Verstärkung der glycemischen Kontrolle in Typ 1 und Typ 2 von Diabetes mellitus erzielen kann. Die Regulationsfähigkeit dieser beiden gegenläufigen metabolischen Reaktionswege basiert auf der Bildung eines Biofaktors - und zwar das Fructose-2,6-bisphosphat - das mit unterschiedlichen allosterischen Effekten das nachgeschaltete bifunktionale Enzymsystem der 6-Phosphofructo-1-kinase/Fructose-1,6-bisphosphatase steuert. Im Verständnis der regulatorischen Kraft der Fructose-2,6-bisphosphatase steckt nicht nur die Möglichkeit dieses zusammen geschaltete bifunktionale Enzym besser zu verstehen, es erlaubt auch über eine allenfalls mögliche pharmakologische Inhibierung für moderne Behandlungen von Diabetes mellitus nachzudenken. Die Bifunktionalität legt nahe, dass das Enzym eine Struktur aufweisen sollte in der zwei aktive Zentren räumlich von einander getrennt vorliegen. Um sowohl Struktur wie auch dynamische Untersuchungen durchführen zu können, sind NMR Untersuchungen an der Fructose-2,6-bisphosphatase, im Zuge des Projektes 13909 erfolgreich durchgeführt worden. Unsere Untersuchungen haben zu einer Zuordnung von über 93 % der 220 Aminosäuren des Proteins geführt.