SP-A/SP-B als Marker von Abstoßung/Infektion nach Lungentransplantation

Nach einer Lungentransplantation besteht die Gefahr der Abstoßung bzw. Infektion des Organs. Wenn im Fall einer Abstoßung bzw. Infektion die richtige Diagnose nicht rasch gestellt und die entsprechende Therapie eingeleitet wird, dann kann sich daraus eine Lungenfunktionsstörung bis hin zum Lungenversagen entwickeln. Wie Untersuchungen an Patienten zeigen, liegt nach einer Lungentransplantation eine Dysfunktion des Surfactantsystems der Lunge vor. Darüber hinaus können bei Abstoßung und Infektion entzündliche Veränderungen des Gewebes sowie eine Erhöhung der Durchlässigkeit der alveolokapillären Membran nachgewiesen werden. Interessanterweise finden sowohl wir (unveröffentliche Ergebnisse) als auch andere Forschungsgruppen, daß die Konzentrationen für die Surfactantproteine A und B im Plasma bei akuten und chronischen Lungenerkrankungen erhöht sind. Daher ist es vorstellbar, daß die Konzentrationen bei Abstossung und Infektion ebenfalls erhöht sind. Weiters ist es möglich, daß sich der Konzentrationsanstieg für Surfactantprotein A und B im Plasma bei einer Abstoßung aufgrund der unterschiedlichen Pathogenese von demjenigen einer Infektion unterscheidet. Ziel der Studie ist es daher zu untersuchen, ob 1) bei Abstoßung und Infektion die Konzentrationen für Surfactantprotein A und B im Plasma erhöht sind, und 2) ob Surfactantprotein A und B aufgund des unterschiedlichen Anstiegs im Plasma als biologische Marker zur Diagnose von Abstoßung und Infektion bei Patienten nach Lungentransplantation geeignet sind.

1. Einleitung Auf der Suche nach einem Serumparameter zur Überwachung von Infektion oder Abstossungs-reaktion bei Patienten nach Lungentransplantation (LuTX) bieten sich Surfactantproteine an, da 1) diese beim Gesunden nur in Spuren im Blut vorhanden sind, jedoch bei einer Schädigung des Lungengewebes in vermehrtem Umfang von der Lunge in die Blutbahn gelangen können, und 2) möglicherweise in unterschiedlicher Konzentration und Geschwindigkeit bei einer regional umschriebenen Schädigung (Infektion) oder einer global ausgedehnten Schädigung (Abstossung) auftreten. 2. Methodenentwicklung und Analyse von Patientenseren Ziel des Projekts war es, mittels verschiedener Analysemethoden (Immunoassay, HPLC) Konzentrationsänderungen der Surfactantproteine im Serum zu messen. Dabei sollten die hydrophilen Surfactantproteine A und D (SP-A und SP-D) bzw. die hydrophoben Surfactant-proteine B und C (SP-B und SP-C) erfaßt werden. 2.1 Nachweis mittels Immunoassay Gereinigtes SP-A konnte mittels ELISA bis zu einer unteren Nachweisgrenze von 18.75 ng/ml nachgewiesen werden. Mit dem deutlich sensitiveren DELFIA-Meßprinzip konnte die Nachweisgrenze weiter auf 2 ng/ml gesenkt werden. Isoliertes, humanes SP-B konnte mittels DELFIA bis 3 ng/ml gemessen werden, jedoch mit einer deutlich geringeren, maximalen Signalintensität als bei SP-A. Versuche, Surfactantproteine im Serum direkt zu messen bzw. die Vorbehandlung des Serums mit Detergenzien, EDTA, Lipase oder mittels Immunpräzipitation zeigten keinen Erfolg. Erst durch eine Zusammenarbeit mit IRC - International Reagents Corporation (Kobe, Japan) und einem SP-D Testkit von der Firma Yamasa konnten Serumproben auf SP-A und SP-D analysiert werden. 2.2 Nachweis mittels High-Performance Liquid Chromatografie (HPLC) Aufgrund der Heterogenitität der Surfactantproteine wurden unterschiedlichste Trennverfahren angewandt: Reversed-Phase Chromatografie mit Ionenpaar-Reagenzien, Size-Exclusion-Chromatografie - Gelfiltration und Gelpermeation, Ionenaustauschchromatografie und Affinitätschromatografie. Bei allen beschriebenen HPLC- Meßmethoden traten immer wieder ähnliche Probleme, wie unterschiedliche Löslichkeit der Proben, Oligomerisation und unspezifische Spektren der Surfactantproteine, Eigenabsorption der Additive, fehlende bzw. unspezifische Antikörperbindung, sowie Memory-Effekte und schlechte Reproduzierbarkeit. Daher konnten bis jetzt keine Patientenproben zuverlässig analysiert werden. Es konnten nur Informationen über das Verhalten der isolierten Einzelproteine bei unterschiedlichen Umgebungsbedingungen (Lösungsmittelpolarität, Detergenzien, Ionenstärke, pH-Wert, Temperatur, etc.) gewonnen bzw. Aussagen über die Affinität bestimmter Antikörper mit Surfactantproteinen gemacht werden. 3. Patientenübersicht/Probenübersicht Insgesamt wurden während der Projektdauer 18 Patienten transplantiert. Den Patienten wurde vor bzw. täglich nach LuTX für maximal 3 Wochen und bei Nachkontrollen Blut abgenommen. Von den gesamt 730 Serumproben wurden bis jetzt 616 Proben auf SP-A und 703 auf SP-D analysiert. Diese Meßwerte werden nun mit dem klinischen Verlauf (Abstoßung/Infektion) korreliert.