Untersuchung der Regulationsmechanismen eines neuartigen Tumortherapeutikums auf das Onkogen Ras und den Tumor Suppressor p53

Forschungsprojekt P 13970Untersuchung der Regulationsmechanismen eines neuartigen Tumortherapeutikums auf das Onkogen Ras und den Tumor Suppressor p53Burkhard JANSEN11.10.1999 Ras Proteine sind essentielle Komponenten für die Weiterleitung von Signalen, welche Zellwachstum, Differenzierung und das Überleben der Zelle regulieren. Sie sind innen an der Plasmamembran mittels eines Farnesyl-Isoprenoidrests verankert. Der Mechanismus dieser isoprenoid-abhängigen Verankerung ist bislang ungeklärt. In unseren vorangegangenen Studien konnten wir zeigen, daß Isoprenoidanaloga in der Lage sind die Interaktionen von Ras mit Bindungskomponenten der Zellmembran zu lösen. Bewiesen wurde dies durch eine Zunahme der lateralen Beweglichkeit von Ras Proteinen durch Isoprenoidbehandlung und eine darauffolgende Lösung aus der Membran. Dies führt zu einer Abnahme von oncogenem Ras in Tumorzellen (Ratte, Human), einer Hemmung des Ras Signalweges, einer Steigerung der Expression des Tumor Suppressors p53 sowie des den Zellzyklus regulierenden Proteins WAF1. Es ist wahrscheinlich, daß eine Protein - Protein Interaktion für die Verankerung von Ras in der Membran verantwortlich und für die Entwicklung und Progression von humanern Krebs absolut notwendig ist. In rezenten Experimenten. konnten wir durch selectives cross-linking ein Ras- bindendes Membranprotein identifizieren und bereits teilweise reinigen. Weites konnten wir zeigen, daß ein Isoprenoidanalogon, welches die Funktion von Ras und damit das Ras-abhängige Tumorwachstum hemmt, das cross-linking der beiden Proteine verhindert. Unsere Hauptziele sind nun die 100%ige Reinigung dieses Ras-bindenden Membranproteins urn zu sehen, ob es als Isoprenoid - abhängiges Ras Ankerprotein (IDRA - isoorenoid-dependent Ras anchorage) wirkt. Weiters wollen wir die Effekte von IDRA auf die Ras Verankerung und die Signalübermittlung untersuchen. Um dies zu erreichen, werden wir einen Teil der Aminosäurensequenz des Proteins bestimmen und anschließend die cDNA, aus einer Ratten -und einer humanen cDNA library, klonen. Ein vollständiger Klon wird dann für die Expression des kodierten Proteins verwendet um zu prüfen, ob es als spezifisches IDRA Protein in Frage kommt. Folgende Punkte sollen in dieser Studie untersuchet werden: 1) Ist die Assoziation von IDRA mit Ras wirklich vom Ras Isoprenoidrest abhängig? 2) Können Isoprenoidanaloga diese Interaktion verhindern? 3) Hat der Status der Guanin-Nucleotid-Bindung von Ras einen Einfluß auf diese Interaktion? 4) Weiters wird die Spezifität von IDRA zu verschiedenen Ras Isoformen und zu anderen GTP bindenden Proteinen untersuchet. 5) Therexpressions- und andere Regulationsexperimente (Antisense Oligonucleotide) werden uns Aufschluß über die biologische Relevanz von IDRA geben (Ras Verankerung in der Membran, Ras Signalleitung, Potential zur Zelltransformation). 6) Weiters, werden wir den Einfluß von Isoprenoidanaloga auf p53 (wt oder mutiert) und p53 assoziierte oder regulierte Faktoren (AMM2, waf1, c-fos, c-jun and JNK) bestimmen. Die Beziehung zwischen diesen Effekten, Ras und IDRA wird untersucht. Ras Proteine sind Regulatoren von wesentlichen physiologischen Prozessen und daher äußerst wichtig für das Aufrechterhalten des zellulären Gleichgewichts. Fehlfunktionen von Ras haben bedeutenden Einfluß auf die Entwicklung, Progression und Therapieresistenz humaner Tumoren gegenüber etablierter Behandlungsmethoden. Deshalb ist die Aufklärung der normalen und pathologischen Funktionen von Ras von äußerster Wichtigkeit und kann zur Entwicklung von neuen Strategien zur Behandlung humaner Tumoren führen.

Im Rahmen dieses Projektes untersuchten wir die Wirkmechanismen und die biologische Aktivität des neuartigen Ras Inhibitors, Farnesyl Thiosalizylsäure (FTS). Unsere Studien ergaben, daß FTS sowohl oncogenes Ras als auch das Tumor Suppressor Protein p53 in Dickdarmkrebszellen reguliert. Weiters sensibilisiert FTS sowohl Dickdarm - als auch Pankreastumorzellen gegenüber Standard Chemotherapeutika und chemosensitiviert Melanomzellen in vivo. Ras Proteine sind essentielle Komponenten in der Weiterleitung von Signalen, welche das Zellwachstum, die Differenzierung und das Überleben der Zelle regulieren. Sie sind in der inneren Schicht der Plasmamembran, mittels eines Farnesyl-Isoprenoidrests verankert. Der Mechanismus dieser isoprenoid-abhängigen Verankerung war bislang ungeklärt und bedarf auch weiterhin intensiven Untersuchungen. In unseren vorangegangenen Studien konnten wir zeigen, daß Isoprenoidanaloga, wie zum Beispiel Farnesyl Thiosalizylsäure (FTS), die Interaktionen, von Ras mit Bindungskomponenten in der Membran, lösen. Bewiesen wurde dies, durch eine Zunahme der lateralen Beweglichkeit von Ras Proteinen durch Isoprenoidbehandlung und eine darauffolgende Lösung aus der Membran ins Cytosol. Dies führt zu einer Abnahme von oncogenem Ras in Tumorzellen (Ratte, Human) und daher zu einer Hemmung des Ras Signalweges. Behandlung verschiedenster Krebszellen mit FTS bewirkte eine eindeutige Reduktion des Zellwachstums durch eben diesen Mechanismus. Wir konnten zeigen, daß FTS in Dickdarmkrebszellen über diesen bekannten Mechanismus wirkt aber zusätzlich noch einen weiteren wichtigen Faktor, nämlich das Tumor Suppressor Protein p53, aktiviert. p53 ist ein wichtiger Regulator des Zellzyklus und des programmierten Zelltodes (Apoptose). FTS hatte nun in diese Zellen nicht nur das Potential Ras aus der Membran zu lösen, sondern aktivierte auch noch p53. Dies resultierte in einem Arrest des Zellzyklus in der GO/G1 Phase und führte daher zum Stop der Zellteilung. Die Folge dieser Co-Regulation war eine dramatische Reduktion des Wachstums der getesteten Dickdarm-krebszellen, sowohl in Zellkulturexperimenten, als auch in Maus Transplantationsstudien. Oncogenes Ras ist bekannt als eine der wichtigsten Komponenten welche zur Manifestation von Resistenz gegenüber klassischer Chemotherapeutika führt. Eine Reduktion von mutiertem Ras Proteinen sollte daher zu einer Chemosensitivierung dieser Zellen führen. Wir konnten zeigen, daß FTS ein hohes Potential zur Chemosensitivierung von Dickdarm -und Pankreaskrebszellen besitzt. Zellen die mit FTS behandelt wurden zeigten eine stark erhöhte Sensitivität gegenüber den Standardchemotherapeutika Doxorubicine und Gemcitabine in vitro. Pancreaskrebszellen die in Mäuse transplantiert wurden zeigten auch eine erhöhte Sensitivität gegenüber Gemcitabine wenn sie in Kombination mit FTS behandelt wurden. Die Lebensspanne dieser kombinationsbehandelten Mäuse konnte um 65% verlängert werden. Die Kombinationstherapie von FTS und dem Standard-chemotherapeutikum für Melanom - Dacarbazine (DTIC) - in Maus Xenotransplantations Experimenten zeigte eine enorm gesteigerte Sensitivität dieser Transplantate gegenüber DTIC. Die Inhibierung des Tumorwachstums betrug in der Kombinationsgruppe 56% gegenüber den Kontrollgruppen. Im Rahmen dieses Projektes bewiesen wir das anticarcinogene Potential des Ras Inhibitors FTS, welcher sich für eine vielversprechende Behandlung von humanem Kolon -und Pankreascarcinom und malignem Melanom anbietet, nämlich sowohl als Einzelmedikament, als auch in Kombination mit klassischen Chemotherapeutika.