Protein C Inhibitor und Retinoide

Serpine (Serinprotease-Inhibitoren) sind eine Familie verwandter Glycoproteine, die Serinproteasen inaktivieren, indem sie mit ihnen enzymatisch inaktive, stabile 1:1 Komplexe bilden. Sie sind beteiligt an der Regulation der Aktivität von Protease-Systemen wie z.B. dem Blutgerinnungssystem, dem fibrinolytischen System sowie anderen intra- und extravaskulären Proteasesystemen. Neben diesen Inhibitoren von Serinproteasen hat die Serpin-Famlilie auch Mitglieder, die keine Hemmaktivität, dafür jedoch andere biologische Funktionen haben. Zu diesen zählen beispielsweise der Hormon-Vorläufer Angiotensinogen oder die Hormon-bindenden Proteine Corticosteroid- bindendes Glubolin (CBG) und Thyroxin-bindendes Glubolin (TBG). Zur Zeit ist völlig unklar, ob auch inhibitorische Mitglieder der Serpin-Familie andere, nicht inhibitorische Funktionen haben. In dem vorigen Projekt (P12308-GEN) konnten wir Befunde erhalten, die erstmals darauf hindeuten, daß ein inhibitorisches Serpin (Proteine C Inhibitor, PCI) spezifisch ein Hormon (retinoic acid) bindet und die biologische Aktivität dieses Hormons in einem Zellkulturmodell erhöht. Unsere und andere Arbeitsgruppen haben weiters gezeigt, daß viele Gewebe, die für Differenzierungs- und Reifeprozesse Retinoide benötigen, in hohem Maße PCI exprimieren. Es scheint daher von großem Interesse zu sein, eine mögliche Rolle des PCI innerhalb des Retinoid- Signalübertragungsweges zu analysieren sowie die biologischen Auswirkungen einer solchen Wechselwirkung zu untersuchen. Wir werden die Affinität verschiedener Retinoide für die verschiedenen Formen des PCI (intakt, komplexiert, gespalten) bestimmen und den Effekt von Retinoiden auf die Hemmaktivität und Enzymspezifität des PCI untersuchen. Wir planen auch, die Wechselwirkung von Retinoiden und PCI in Körperflüssigkeiten zu analysieren und sie mit den Reaktionen von Retinoiden mit andern Retinoid-bindenden Proteinen zu vergleichen. Weiters wollen wir die Retinoid-Bindungsstellen innerhalb des PCI-Moleküls identifizieren und den Effekt von PCI auf die Stabilität von Retinoiden sowie auf deren Aufnahme durch Zielzellen untersuchen. Unsere Resultate sollten daher abklären, inwieweit PCI an der Bereitstellung und/oder der Signalübertragung durch Retinoide beteiligt ist. Sie könnten außerdem die Basis für neue Forschungsrichtungen nicht nur auf dem Gebiet der Serpine, sondern auch auf dem Gebiet der Signalübermittlung durch Retinoide darstellen.

Wir untersuchten die Wechselwirkung zwischen einem Proteaseinhibitor (Protein C Inhibitor) und Retinoiden (Abkömmlinge von Vitamin A). Unsere Resultate weisen darauf hin, daß der untersuchte Inhibitor neben der Hemmung von Proteasen noch eine andere Funktion, nämlich im Transport und in der Bereitstellung von Retinoiden für Zellen haben dürfte. Serpine (Serinprotease-Inhibitoren) sind eine Familie von Glykoproteinen, die Inhibitoren von Serinproteasen und nicht-inhibitorische Mitglieder beinhaltet. Nicht-inhibitorische Mitglieder der Serpin-Familie sind z.B. der Hormonvorläufer Angiotensinogen oder die Hormon-bindenden Proteine CBG (Corticosteroid-bindendes Globulin) und TBG (Thyroxin-bindendes Globulin). Zur Zeit ist unklar, ob bzw. in welchem Ausmaß inhibitorische Serpine zusätzliche, nicht-inhibitorische Funktionen haben. Wir untersuchten daher die mögliche Bindung von hydrophoben Hormonen an inhibitorische Serpine. Diese Untersuchungen, in welchen wir Steroidhormone und Retinsäure verwendeten, ergaben, daß Retinsäure an Protein C Inhibitor (PCI) bindet, während für keines der anderen untersuchten Serpine (Antithrombin III, Heparin cofactor II, Plasminogenaktivator-Inhibitor-1) Bindung an eines der verwendeten Hormone (Aldosteron, Cortisol, Östradiol, Progesteron, Testosteron, Retinsäure) nachgewiesen werden konnte. Auch PCI zeigte keinerlei Bindung an Steroidhormone. Wir analysierten daher die Wechselwirkung zwischen PCI und Retinoiden genauer. Wir konnten für die Interaktion von PCI und all-trans-Retinsäure eine KD von 2,43M und 0,8 Retinoid- Bindungsstellen pro Molekül PCI errechnen. Weiters konnten wir feststellen, daß sowohl in gereinigten wie auch in biologischen Systemen Retinsäure hauptsächlich in Verbindung mit einer hochmolekularen PCI-Form, möglicherweise einem Polymer, assoziiert war. Um die Bindungsstellen für Retinoide innerhalb des PCI-Moleküls zu lokalisieren, stellten wir verschiedene PCI Mutanten her. Einer dieser Mutanten fehlt diejenige Aminosäuresequenz, die für die Bindung des PCI an Heparin verantwortlich ist. In anderen Mutanten wurden jeweils einzelne Aminosäuren in bestimmeten Molekülabschnitten durch andere ersetzt. Zur Zeit werden diese PCI Mutanten dahingehend untersucht, inwieweit sie noch imstande sind, Retinoide zu binden. Wir untersuchten auch, in welchem Außmaß PCI andere Lipide bindet. Bis jetzt haben wir Daten, die darauf hinweisen, daß PCI mit hoher Affinität (~10x höher als für Retinoide) Arachidonsäure bindet. Die Zahl der Bindungsstellen für Arachidonsäure (0,1 pro Molekül PCI) lassen jedoch vermuten, daß ein Großteil der Bindungsstellen bereits durch endogene Liganden besetzt ist oder aber daß PCI Polymere bilden muß, bevor er mit einem Molekül Arachidonsäure reagiert. Diese Fragestellungen werden zur Zeit analysiert.