DNA-Analyse durch Kopplung von Trennmethoden mit MS

Die Notwendigkeit zur Analyse von Nucleinsäuren geht hauptsächlich auf die Bedürfnisse der Genetik, Biochemie, Molekularbiologie und medizinischen Diagnostik zurück.. In letzter Zeit wurde die DNA Analytik jedoch vermehrt auf einem eher untypischen Gebiet eingesetzt: in Gerichtsverfahren. In Österreich wird immer häufiger von Kriminalfällen berichtet, die aufgrund der Ergebnisse von DNA Analysen aufgeklärt werden konnten. Die schnell anwachsende Bedeutung der DNA Analyse in der Forensik ist nicht nur das Ergebnis der Aufnahme von DNA Daten in große Datenbanken, sondern auch das Ergebnis der schnellen Entwicklung neuer, leistungsfähiger Technologien zur DNA Analyse. Trenntechniken in flüssiger Phase, wie z. B. Flüssigchromatographie und Elektrophorese, gehören zu den wichtigsten Methoden zur Trennung und Detektion von DNA. In den letzten Jahren hat sich die Massenspektrometrie zu einer weiteren, wichtigen Methode für DNA Analysen weiterentwickelt. Allerdings ist die massenspektometrische Analyse von Nucleinsäuren mit Schwierigkeiten verbunden, die aus der Tendenz zur Bildung von Addukten mit ubiquitär vorkommenden Kationen wie Natrium und Kalium resultieren. Die Entfernung von Salzen und anderen Verunreinigungen aus Nucleinsäure-Probe ist daher unabdingbar, um Massenspektren hoher Qualität auch von geringen Probemengen erhalten zu können. Das primäre Ziel dieses Projektes ist daher die Entwicklung neuer, miniaturisierter Trenntechniken, die sich als online Verfahren zur Probenvorbereitung, Aufkonzentrierung, Entsalzung und Reinigung von Nucleinsäuren für die anschließende massenspektrometrische Untersuchung eignen. Die Entwicklung neuer Methoden für die Analyse von Nucleinsäuren von forensischer Relevanz im Rahmen dieses Projektes besteht in der Kombination verschiedener Technologien, nämlich: 1. Synthese und Modifizierung neuer monolithischer stationärer Phasen, 2. Anwendung der monolithischen stationären Phasen für miniaturisierte Trenntechniken, z. B. Kapillar- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrochromatographie, und 3. Kopplung der miniaturisierten Trennmethoden mit der Electrospray- und matrix-unterstützten Laserdesorptions- Massenspektroketrie. Die Miniaturisierung der Trennsysteme wird durch die Synthese und Anwendung von Kapillarsäulen von 50-200 micro-m Innendurchmesser, die stationäre Phasen in monolithischer Morphologie enthalten, erzielt. Die resultierenden Flußraten von 0.1-3 micro-l/min sind optimal für die online Kopplung mit der Electrospray- und matrix-unterstützten Laserdesorptions-Massenspektroketrie geeignet. Der für die Trennung von Nucleinsäuren vorgeschlagene Trennmechanismus ist die lonenpaarchromatographie unter Verwendung einer hydrophoben, polymeren, monolithischen stationären Phase und flüchtiger Eluenten, die eine direkte Ankopplung an die Massenspektrometrie erlauben. Die entwickelten und optimierten Analysensysteme werden für die Analytik von Oligonucleotiden, PCR Produkten, und DNA Restriktionsfragmenten von forensischer Relevanz angewandt.

Durch die genaue Messung der Masse von DNA Molekülen mit Hilfe der Massenspektrometrie ist es möglich, wertvolle Informationen über Gensequenzen in biologisch relevanten Proben zu erhalten. Bis dato war diese Methodik jedoch wegen des relativ großen Probenbedarfes nur bedingt einsetzbar, da reale Proben, wie sie zum Beispiel in der Gerichtsmedizin untersucht werden, üblicherweise nur sehr geringe Mengen an DNA Material enthalten. Im Rahmen des Projektes P-14133-PHY ist es einem Team um den Analytischen Chemiker Christian Huber am Institut für Analytische Chemie und Radiochemie der Uni Innsbruck in Zusammenarbeit mit dem Molekularbiologen Walther Parson vom innsbrucker Institut für Gerichtsmedizin und dem aus Innsbruck stammenden Mediziner Peter Oefner vom Genome Technology Center der Stanford University, Kalifornien, gelungen, auch geringste DNA-Mengen zu untersuchen. Durch Weiterentwicklungen besonders in der Probenvorvereitung ist die Massenspektrometrie nun auch für Mikrospuren einsetzbar, die nur ca. 100 Pikogramm an DNA Material enthalten. Die neu entwickelte Methode stellt einen wichtigen Schritt in Richtung alternativer Methoden für die forensische und genetische DNA Untersuchung dar. Obwohl in den letzten Jahren eine Reihe von neuen, DNA-basierenden Technologien vorgestellt wurden, verliefen die meisten Vorschläge im Sand, weil sie nicht spezifisch oder sensitiv genug waren, um Realproben zu analysieren. In der Forensik wird zum Beispiel üblicherweise mit Hilfe der Elektrophorese als Analysenmethode die Länge bestimmter DNA-Fragmente bestimmt, um eine Verbindung zwischen DNA-Spur und möglichem Täter herzustellen. Die Massenspektrometrie misst nun statt der Länge die Masse von DNA-Molekülen, und zwar in kurzer Zeit und mit sehr hoher Genauigkeit. Um die notwendige Genauigkeit zu erzielen, müssen die DNA-Proben jedoch vorher stark aufgereinigt werden. Für diese Reinigung wird die Technik der Flüssigkeitschromatographie eingesetzt, bei der die DNA-Probe über ein poröses Polymermaterial mit charakteristischen Oberflächeneigenschaften gepumpt wird. Die DNA wird auf dem Polymer zurückgehalten, während Verunreinigungen passieren. Anschließend wird die DNA direkt vom porösen Material in ein Gerät zur Massenmessung, ein sogenanntes Massenspektrometer, überführt. Obwohl es zwischen den Genomen zweier Menschen nur minimale Unterschiede gibt (einen in ca. 500-20000 Basen), reicht die Untersuchung mehrerer solcher unterschiedlicher Stellen für die Erstellung eines für jeden Menschen charakteristischen DNA-Profils. Statistisch gesehen müssen mindestens eine Milliarde unverwandter Personen untersucht werden, um ein solches DNA-Profil in der Bevölkerung zufällig ein zweites Mal zu finden. Anhand dieser DNA-Profile können Täter mit hoher Sicherheit überführt oder aber auch Unschuldige von einer Täterschaft vollkommen ausgeschlossen werden. Die Vorteile der neuen Methode der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie liegen in der hohen Präzision der Ergebnisse, im höheren Informationsgehalt aufgrund der genauen Massenmessung, in einer hohen Automatisierbarkeit in der Labor-Routine, und darin, dass man damit viele Proben in kurzer Zeit analysieren kann, was im Hinblick auf die rasch expandierenden DNA Datenbanken unerlässlich ist.