Klonierung eines Ovarialkarzinomtumorsuppressorgens

Forschungsprojetk P 14138Klonierung eines OvarialkarzinomtumorsuppressorgensMichael KRAINER24.01.2000 Der Ausfall der Funktion von Tumorsuppressorgenen (TSG) durch inaktivierende Mutationen, Promotermethylierung oder andere bis dato unbekannte Störungen der Transkription ist eine der treibenden Kräfte in der Entstehung maligner Tumore. Der erste Schritt um Regionen im menschlichen Genom zu finden, die mögliche Tumorsuppressorgene beinhalten, ist die Untersuchung des Verlusts von genetischem Material durch den Vergleich von Tumor- und Keimbahn DNS desselben Patienten. Mittels Mikrosatellitenanalyse am kurzen Arm des Chromosom 8 haben wir drei Regionen identifiziert, bei denen es bei Ovarialkarzinomen häufig zu einem Verlust der Heterozygosität gekommen ist. Eine dieser Regionen, die durch den Verlust der Heterozygosität von Mikrosatellitenmarkern D8S1992-D8S261 gekennzeichnet ist, ist von besonderem Interesse, da sie vorwiegend bei Tumoren im Frühstadium gefunden wurde. Darüberhinaus scheint dieser Genabschnitt in der Entstehung einer Reihe verschiedener anderer Karzinome involviert zu sein, insbesonders bei Prostatakarzinomen, wo eine Region homozygoten Verlusts in diesem Bereich bekannt ist. Durch Bearbeitung verschiedener elektronischer Datenbanken haben wir zusätzliche genetische Marker in der Deletion identifiziert, mit denen wir das bereits vorhandene Tumormaterial nochmals analysierten. Dadurch waren wir in der Lage den Verlust der Heterozygosität in den Ovarialkarzinomen besser in die Genemap99 und die G3 Stanford Radiation Hybrid Map zu integrieren. Die kleinste Deletion ist nun um die 900 Kilobasen. Im Moment untersuchen wir exprimierte Sequenzabschnitte und Gene, die in dieser Region beschrieben sind, als Kandidatengene. Wir werden weiters mit Hilfe der bereits identifizierten Marker genetisches Material aus der Region in der Form bakterieller künstlicher Chromosomen (BACs) aus DNA Bibliotheken isolieren. Diese K-Ione werden uns mittels in situ Hybridisierungsexperimenten helfen, die Region genauer zu kartieren und auch mögliche homozygote Deletionen zu identifizieren. Mögliche kodierende Sequenzen werden wir aus diesen BACs mittels Exon Amplifikation isolieren. Diese potentiellen Exons zusammen mit den Endsequenzen werden uns helfen, die BACs in Beziehung zueinander zusetzen und die gesamte Deletion mit geklonter DNA abzudecken. Diese physisch isolierten Transkripte werden gemeinsam mit den in den Datenbasen vorhandenen Sequenzen durch Mutationsanalysen in Zelllinien, Tumoren und in der Keimbahn DNA von Ovarialkarzinompatientinnen als Kandidatengene evaluiert werden. Nachdem wir ein Ovarialkarzinomtumorsuppressorgen mittels Mutationsanalysen identifiziert haben, werden wir unsere Daten mit funktionellen Untersuchungen untermauern.

Die Entstehung eines Tumors wird durch die Aktivierung von Onkogenen und den Funktionsverlust von Tumor Suppressor Genen (TSG) gesteuert. In jüngster Zeit konnten wir und andere Gruppen zeigen, daß es bei Ovarialkarzinomen häufig zu einem Verlust von genetischem Material am kurzen Arm des Chromosom 8 kommt. Diese Beobachtung ist ein starker Hinweis darauf, daß diese chromosomale Region potentielle TSG beherbergt, die eine kausale Rolle beim Ovarialkarzinom spielen könnten. In den vergangenen zwei Jahren haben wir diese Region am Chromosom 8 sorgfältig kartiert und haben eine Vielzahl rekombinanter bakterieller Chromosomen (BAC) aus humanen DNA Bibliotheken isoliert, um das genetische Material aus dieser Region für weitere Untersuchungen lückenlos zur Verfügung zu haben. In der Folge haben wir mit molekulargenetischen und bioinformatischen Methoden potentielle kodierende Sequenzen isoliert. Momentan arbeiten wir an im Rahmen des Human Genom Projekts erarbeiteten Sequenzen, an Expressed Sequence Tags (EST), die in die Region mappen, und an durch Exon Trapping aus der Region isolierten Exons. Die Evaluierung von Kandidatengenen ist herausfordernd, da der Nachweis von Mutationen oder anderen Formen der Inaktivierung von Genen, wie z.B. Methylierung arbeitsintensiv ist. Homozygote Deletionen sind für gewöhnlich kleiner als Regionen herterozygoten Verlusts und sind oft eine Vorbedingung für die erfolgreiche Isolierung von TSGs, da die Zahl an Kandidatengenen, die untersucht werden müssen, geringer ist. Während wir einerseits neue Methoden entwickeln, um Regionen homozygoten Verlusts zu identifizieren, konnten wir mit konventionellen Methoden eine solche in einer Pankreaskarzinomzellinie identifizieren. Aus dieser Deletion, die sich über 685 Kilobasen erstreckt, sollte es relativ einfach sein, ein Gen zu isolieren. Neben der Suche nach neuen Genen arbeiten wir darüber hinaus an vielversprechenden Kandidatengenen, die in der weiteren Region liegen. Dies inkludiert Rezeptoren für den TNF- related apoptosis inducing ligand (TRAIL). In Kombination sollten diese unterschiedlichen Annäherungsversuche ein Licht auf die Ursache des häufigen Verlusts verschiedener Regionen am Chromosom 8p21 werfen. Dies wird im Laufe des Projekts zur Identifizierung neuer Gene, die in die Entstehung des Ovarialkarzinoms involviert sind, führen. In Verbindung mit einer Charakterisierung gefundener Genen wird dies zu einem besseren Verständnis der Tumorbiologie und letztendlich zu einer Verbesserung der diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten für Patienten mit Ovarialkarzinomen führen.