Genetisches ´Carbohydrate-Engineering´

Forschungsprojekt P 14209Genetisches "Carbohydrate-Engineering"Paul MESSNER 06.03.2000 Das Ziel des beantragten Forschungsprojekt umfaßt, zum ersten Mal bei Gram-positiven Eubakterien, die Herstellung von S-Schicht-Neoglykoproteinen mit artifiziellen Glykanketten durch genetische Methoden. Zusätzlich sollen in weiteren Arbeiten die Grundlagen für die Produktion von S-Schicht-Neoglykoproteinen mit Glykanketten von Kapselpolysacchariden oder Proteoglykanen durch genetisches "Carbohydrate-Engineering" erarbeitet werden. Für das geplante dreijährige Projekt wurden die S-Schichtglykoproteine der Gram-positiven, thermophilen Eubakterien Aneurinibacillus thermoaerophilus L420-91T und GS4-97 sowie Bacillus stearothermophilus NRS 2004/3a ausgewählt. Die aus identen Wiederholungseinheiten aufgebauten Glykane der S-Schichtglykoproteine der beiden A. thermoaerophilus-Stämme bestehen aus Zuckerketten mit je vier D-Rhamnose-Resten, von denen jeweils zwei benachbarte D-Rhamnosen mit je einem 3-N-Acetyl-D-Fukosamin-Rest substituiert sind. Die Glykane von B. stearothermophilus bestehen dagegen aus linearen Poly-L-Rhamnan-Ketten. Ziel des Projektes ist es, durch "Carbohydrate-Engineering" ausschließlich mit genetischen Methoden, die Struktur der vorhandenen Zuckerketten in den S-Schichtglykoproteinen gezielt zu verändern und damit artefizielle S- Schicht-Neoglykoproteine zu schaffen. Im ersten Projektjahr sollen die Voraussetzungen dafür durch Klonierung und Sequenzierung der an der Biosynthese der GDP-D-Rhamnose beteiligten Gene gmd und rmd geschaffen werden. Weiters ist es notwendig, für die Enzyme der Biosynthese von 3-N-Acetyl-D-Fukosamin geeignete Analysenmethoden zu entwickeln. Im zweiten Projektjahr ist vorgesehen, die an der Synthese des Aminozuckers beteiligten Gene zu klonieren und zu sequenzieren. Zusätzlich soll die Charakterisierung der S-Schichtprotein- Gene satA bzw. satB von A. thermoaerophilus sowie sbsD von B. stearothermophilus abgeschlossen werden. Dadurch werden die Voraussetzungen für die Ermittlung der Position des "S-Schichtglykanbiosynthese"-Clusters von A. thermoaerophilus im Bezug zum S-Schichtprotein-Gen satA/satB geschaffen. Durch gezielte Mutationen sollen im dritten Projektjahr die Strukturen der Zuckerketten von A. thermoaerophilus dahingehend verändert werden, daß keine 3-N-Acetyl-D-Fukosamin-Vorstufen mehr synthetisiert werden und damit anstelle der verzweigten Glykane lineare Poly-D-Rhamnan-Ketten entstehen. Bei B. stearothermophilus soll durch eine äquivalente Mutation die Glykansynthese völlig ausfallen und ein nichtglykosyliertes S-Schichtprotein gebildet werden. Da für bestimmte Anwendungsaspekte die Ausbildung einheitlicher Kettenlängen der Zucker von entscheidender Bedeutung ist, soll im dritten Projektjahr die Polymerisation der Wiederholungseinheiten der Zuckerketten und damit deren Längenverteilung analysiert werden. Dafür sind auch Untersuchungen der zellulären Topographie der Glykosylierungsreaktionen mittels Immunelektronenmikroskopie von Antikörper-markierten Präparaten vorgesehen. Durch die vorgeschlagenen Untersuchungen sollen die Voraussetzungen für das "Carbohydrate-Engineering" von S-Schicht-Neoglykoproteinen geschaffen werden. Derartige Substanzen sind wichtige Zielstrukturen im Bereich von Biomedizin und Nanotechnologie.

Bei vielen Gram-positiven Bakterien beobachtet man an ihrer Zelloberfläche regelmässig angeordnete Proteinkristalle, die so genannten S-Schichtproteine (S-Schichten). Bei einigen Stämmen können diese auch glykosyliert sein können, das heißt, dass Zuckerketten kovalent an das Protein gebunden vorliegen. Die chemische Struktur der Zuckerketten von S-Schicht-Glykoproteinen von ausgewählten Mikroorganismen wurde bereits in früheren Projekten ermittelt. Im vorliegenden Projekt sollten erstmals die an der Biosynthese der Glykanketten beteiligten Gene mit molekularen Methoden vollständig erfasst werden. Damit sollten Ansatzpunkte für ein gezieltes "Carbohydrate Engineering", d.h. eine spätere, gezielte Veränderung der vorliegenden Zuckerstrukturen der S-Schicht-Glykoproteine durch genetische Manipulation, ermittelt werden. Diese Arbeiten inkludierten die Erfassung aller im S-Schichtglykan- Cluster vorkommenden Gene bei mehreren ausgewählten Bakterienstämmen. Weiters sollte die Funktion bestimmter Gene ausgeschaltet und neue Gene in den Organismus eingebracht und integriert werden. Die Transformierbarkeit der verwendeten thermophilen Mikroorganismen erwies sich als problematisch und konnte bisher nicht befriedigend gelöst werden. Daraus resultierte, dass sich die Arbeiten vorerst auf die Klonierung und Sequenzierung der in den Glykosylierungs-Cluster vorkommenden Gene und die funktionelle Charakterisierung der von ihnen kodierten Enzymproteine konzentrierten. Weiters wurde ein Modell für die mögliche Biosynthese von glykosylierten S-Schichtproteinen von Gram-positiven Bakterien erstellt. Das im Projekt angestrebte "Carbohydrate Engineering" zielt auf eine zukünftige Anwendung von glykosylierten bakteriellen S-Schichtproteinen mit exakt definierten Zuckerstrukturen bzw. S-Schichtneoglykoproteinen mit neuen Glykanstrukturen in verschiedenen Bereichen der Nanobiotechnologie, Biomimetik und Biomedizin.