Erytropoetin und Hämbiosynthese

Forschungsprojekt P 14215Erythropoetin und HämbiosyntheseGünter WEISS 24.01.2000 Erythropoetin (EPO) stimuliert die Bindungsaffinität von "iron-regulatory protein-1 (IRP-1)" zu spezifischen RNA- Schleifenstrukturen, sogenannten iron-responsive elements (IRE), wodurch er zu einer erhöhten Transferrin Rezeptoren (TfR) Expression und vermehrter Aufnahme von Eisen in erythroide Zellen kommt. Wir wollen nun untersuchen, ob ein direkter regulatorischer Einfluß von EPO auf die Hämbiosynthese für diese wichtige Beobachtung verantwortlich sein könnte. Zuerst werden wir in humanen und murinen erythroiden Zellen die Effekte von EPO auf die Aktivität von erythroider 5-Aminolevulinat-Synthase (e-ALAS) überprüfen, dem Schlüsselenzym der Hämbiosynthese, das ein IRE innerhalb der 5` nichttranslatierten Region seiner mRNA enthält. Da -wie erste Experimente andeuten- EPO die e-ALAS Aktivität erhöht, werden wir mittels "RNA-Gelshift Assays" feststellen, ob EPO die Bindungsaffinitäten von IRP-l und IRP-2 zu ferritin-IRE und e-ALAS-W unterschiedlich reguliert. Weitere Versuche sollen klären, ob die Effekte von EPO auf die Aktivitäten von IRP-1 und IRP-2 entweder auf EPO induzierte Signaltransduktions- und Phosphorylierungsprozesse oder auf Veränderungen der intrazellulären Eisenhomöostase zurückzuführen sind. Die Herstellung und Transfektion von Plasmiden die entweder e-ALAS oder ferritin-IRE enthalten, soll überprüfen, inwieweit die Regulation von IRPs durch EPO die Genregulation sowie konsekutiv e-ALAS und Ferritin Transjation gegenläufig beeinflußt. Da Pilotstudien unserer Arbeitsgruppe auf eine Erhöhung von e-ALAS mRNA durch EPO hinweisen, sollen parallel auch mögliche posttranskriptionelle und transkriptionelle Effekte von EPO auf die Expression von e-ALAS und Ferritin mRNA mittels Northen-Blots, mRNA Halbwertszeitbestimmungen und Nuklear-Run-Off Assays untersuchen werden. Transkriptionelle Effekte von EPO sollen mittels Konstruktion und Transfektion von Deletionsmutanten des e-ALAS Promotors, in vitro Footprinting, DNA-Gelshiftassays und Mutationsanalysen der DANN-Bindungsstellen von potentiellen EPO-sensitiven Transkriptionsfaktoren exploriert werden. Unser Projekt könnte einen komplexen regulatorischen Mechanismus zwischen EPO-Wirkung, Eisenstoffwechsel und Hämbiosynthese aufdecken und die erste Evidenz für eine gegenläufige Regulation von Eisenspeicherung (Ferritin) und Eisenverbrauch (e-ALAS/Hämsynthese) in erythroiden Zellen liefern. Aufgrund unserer Arbeitshypothese dürfte EPO die Hämbiosynthese über transkriptionelle und translationale Induktion der e-ALAS Expression erhöhen und gleichzeitig die dafür notwendig Eisenaufnahme in die Zellen durch Stabilisierung der Tfr mRNA über Modulation der IRE/IRP Interaktion erhöhen, während die Ferritinsynthese über diesen Mechanismus blockiert wird. Unsere gewonnenen Ergebnisse dürften von großer klinischer Relevanz für die Entwicklung verbesserter Therapiekonzepte zur Behandlung von Patienten mit renäler Anämie und Anämie chronischer Erkrankungen sein.

Im Rahmen dieses FWF-Projektes beschäftigten wir uns mit den Mechanismen der Anämie chronischer Erkrankungen, den Zusammenhängen von Eisenstoffwechsel, Eisentransport, Blutbildung und lmmunologie sowie deren Veränderung im Rahmen von inflammatorischen Erkrankungen wie Infektionen oder Autoimmunerkrankungen und deren Bedeutung für die Regulation der Immunantwort. Wir konnten dabei folgende neue Erkenntnisse gewinnen: A) Unter Verwendung eine Zellkulturmodelis konnten wir erstmals nachweisen, dass Erythropoietin (Epo), eine von der Niere gebildetes Hormons, das die Blutbildung stimuliert, die Synthese des Enzyms erythroide Aminolevulinsäure Synthase (e-ALAS) über verschiedene molekulare Mechanismen reguliert und damit die Synthese des Moleküls Häm und in weiterer Folge des roten Blutfarbstoffes Hämoglobin direkt stimuliert. Weiters induziert Epo die Aufnahme des für die Hämoglobinbildung essentiellen Moleküls Eisen in erythroide Vorläuferzellen, also jene Zellen, aus denen reife Erythrozyten gebildet werden. Somit konnte ein neuer Mechanismus aufgeklärt werden, wie Epo die Blutbildung beeinflusst, was enorme praktische Auswirkungen auf die Behandlung der Blutarmut im Zusammenhang mit chronischen Infektionen, Tumorerkrankungen oder Autoimmunprozessen, der sog. Anämie chronischer Erkrankungen (ACD), hat. B) Bei zwei wesentlichen Erkrankungen, die mit Veränderungen der Eisenhomöostase vergesellschaftet sind, nämlich der ACD, der häufigsten Blutarmut bei hospitalisierten Patienten und der primären Eisenüberladung (Hämochromatose), der wohl häufigsten Erbkrankheit in Nord- und Mitteleuropa, haben die zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanismen untersucht. Wir konnten zeigen, dass Immunbotenstoffe (Zytokine) den Eisenstoffwechsel in Makrophagen (Körperfresszellen) derart beeinflussen, das es zu einer Speicherung dieses essentiellen Elements in diesen Immunzellen kommt und somit Eisen nicht mehr für die Blutbildung zur Verfügung steht, wodurch es zur Entwicklung der ACD kommt. Dieser Ergebnisse wurden durch von uns durchgeführte Untersuchungen zur Anämie bei Malaria und Auto-immunerkranungen (Mb. Crohn) untermauert. Bei der Hämochromatose kommt es zu einer unregulierten Aufnahme von Eisen aus dem Darm, dass sich in Herz, Leber oder Bauchspeicheldrüse ablagert, wodurch es dann zur Entwicklung einer Leberzirrhose oder eines Herzversagens kommt. Wir konnten aufzeigen, aufgrund welcher molekularen Mechanismen im Darm es zur Entwicklung der Hämochromatose kommt und sind basierend auf diesen Ergebnissen derzeit damit beschäftigt, eine neue spezifische Therapie der Hämochromatose zu entwickeln.