Interferon-a und die Regulation der hepatischen TPO-Synthese

Forschungsprojekt P 14223Interferon-a und die Regulation der hepatischen TPO-SyntheseMarkus PECK- RADOSAVLJEVIC 24.01.2000 Interferon-alpha ist derzeit die einzige etablierte Therapie bei chronischer Hepatitis C, einer Infektionskrankheit, welche alleine in Österreich über 50 000 Patienten betrifft und nach jahrelangem Verlauf zu Leberzirrhose und hepatozellulären Karzinom führt. Obwohl die Therapie mit Interferon oft gut vertragen wird, so führt sie doch in fast allen Fällen zu einem Abfall der Blutplättchenproduktion im Knochenmark, welcher manchmal so gravierend ist, dass die Interferon-Therapie abgebrochen werden muß. Die Bildung der Blutplättchen wird durch einen vom Körper in der Leber gebildeten Wachstumsfaktor selbst geregelt, welcher Thrombopoietin genannt wird. Erst kürzlich konnten wir zeigen, dass die Produktion dieses Wachstumsfaktors in der Leberzelle durch Interferon-alpha gehemmt wird, der Mechanismus dieser Hemmung ist jedoch nicht bekannt. Bisher war die vorherrschende Meinung, dass der Thrombopoietinspiegel im Blut nicht über die Produktion, sondern nur über den Abbau durch Binden an Thrombozyten und Megakarzyozyten geregelt wird. Nach neuesten Erkenntnissen kann jedoch sehr wohl eine Regulation der Thrombopoietin Produktion in der Leberzelle auf der Ebene der Translation erfolgen. Diese Regulation erfolgt einerseits bei der Transkription über die Verwendung alternativer Startsignale in der 5`-nichtkodierenden Region, andererseits durch differenzielles Splicing der Thrombopoietin mRNA. Diese Kontrolle der Translation durch differenzielles Splicing stellt den bisher einzigen bekannten Mechanismus zur Kontrolle der Thrombopoietin Proteinproduktion dar. Da die von uns beschriebene Hemmung der Thrombopoitin Produktion durch Interferon-alpha auf der Ebene der Translation oder des Protein- Exports stattfinden muß, möchten wir untersuchen, ob die verminderte Produktion von Thrombopoietin unter Interferon Therapie tatsächlich über diesen Mechanismus reguliert wird. Zu diesem Zweck sollen einerseits die Thrombopoietin Transkription in unterschiedlichen humanen Hepatom Linien im Detail charakterisiert werden, andererseits eine relative Quantifizierung der unterschiedlichen mRNA Spezies mit und ohne Interferon-Therapie in diesen Zell-Linien durchgeführt werden. Weiters soll enben den Untersuchungen auf mRNA Ebene auch eine Quantifizierung des intrazellulären Thrombopoetin Proteins sowie dessen intrazelluläre Verteilung mit und ohne Interferon-Behandlung erfolgen. Ziel der Studie ist eine genaue Charakterisierung der Thrombopoietin-Produktion unter Interferon-alpha Therapie, um längerfristig eine geeignete Strategie zur Bekämpfung des Plättchenabfalls unter Interferon Therapie entwickeln zu können

Interferon- (IFN) Therapie bei Patienten mit chronischer Hepatitis C führt zu einem Abfall der Plättchenzahl im um ca. 30%, welcher in manchen Fällen zur schweren Plättchenarmut führen und einen Therapieabbruch zur Folge haben kann. Dieser Plättchenabfall führt nicht zu dem erwarteten gegenregulatorischen Anstieg des wichtigsten thrombopoetischen Wachstumsfaktors Thrombpoietin (TPO). Wir konnten hier zeigen, dass die IFN-Therapie zu einer Veränderung der Splice-Varianten im proximalen nicht-codierenden Abschnitt der TPO-mRNA führt. Diese hat eine deutliche Verminderung der TPO-Produktion in der Leberzelle unter IFN-Therapie zur Folge und kann den fehlenden TPO-Anstieg bei Patienten mit IFN-induzierter Plättchenarmut erklären. Über den speziellen Fall des TPO`s hinaus stellt dies einen neuen, für IFN bisher nicht beschriebenen Weg der Regulation der Genexpression dar. Die Entwicklung von Substanzen, die auf diese Art in den TPO-Stoffwechsel eingreifen, könnte einerseits neue Ansätze für die Steigerung der körpereigenen TPO-Expression in Fällen von Plättchenarmut bringen. Andererseits könnte diese Art der Genregulation durch IFN den Weg für interessante neue Erkenntnisse über die Wirkung von IFN in der antiviralen und onkologischen Therapie ebnen. Fragestellung: Werden die Veränderung der TPO-Sekretion durch IFN-Therapie durch alternatives Splicen oder durch Splice- unabhängige Mechanismen, wie Änderungen in der subzellulären Verteilung von Thrombopoietin bedingt. Aus der rezenten Literatur war bekannt, dass es in den Hepatozyten verschiedene TPO-mRNA-Spezies gibt, welche sich nur in der 5`-untranslated Region unterscheiden. Diese werden mit sehr unterschiedlicher Effizienz in Protein übersetzt (translatiert). Die mit guter Effizienz translatierte mRNA-Spezies macht nur ca. 2% der TPO- mRNA eines normalen Hepatozyten aus und wir hypothetisierten, dass auch nur eine geringe Verschiebung im Verhältnis der Expression der unterschiedlichen TPO-mRNA`s, z. B. durch den Einfluss der IFN-Therapie, zu einer deutlichen Veränderung der Expression von TPO-Molekülen führen könnte. Ergebnisse: IFN führte in mehreren Zell-Linien zu einer dosisabhängigen Abnahme der TPO-Produktion auf Proteinebene, welche nur zum geringen Teil durch eine verminderte Produktion von TPO-mRNA zu erklären ist, da diese mRNA-Produktionsminderung nur durch sehr sensitive Methoden überhaupt erfassbar ist. Tatsächlich konnte unter IFN-Therapie zumindest in einer der getesteten Zell-Linien mittels Taqman-quantitativer Realtime-PCR eine Verschiebung der TPO-Splice-Varianten von der effizient in Protein übersetzten hin zu den wenig effizient übersetzten Varianten beobachtet werden. Diese Ergebnisse müssen nun noch in anderen Zell-Linien überprüft werden, deuten aber insgesamt auf eine völlig neuartige Regulation der Proteinexpression durch IFN-Therapie hin. Der Nachweis der pharmakologischen Beeinflussung der TPO-Expression könnte das Interesse an der Suche nach Substanzen aufleben lassen, welche die Expression der effektiv translatierten mRNA-Species zu steigern vermögen.