Calmodulin, ein Antagonist der dopaminergen Signalübertragung

Forschungsprojekt P 14273Calmodulin, ein Antagonist der Dopaminergen SignalübertragungChristian NANOFF08.05.2000 Das Catecholamin Dopamin wirkt in ZNS als Neuromodulator. Sein Angriffspunkt, die Dopaminrezeptoren, gehören zur Familie der G-protein-gekoppelten rezeptoren, die - je nach Subtyp - die Aktivität des Effektors Adenylylcyclase steigern oder hemmen. Die Effekte von Dopamin am D2 -Rezeptor sind von Pharmaka in der Behandlung von Psychosen (Positivsymptome der Schizophrenie) und der Parkinson`schen Erkrankung. Nervenzellen im Neostriatum exprimieren D2 -Rezeptoren und werden durch dopaminerge Neurone innerviert. Wenn neostriatale Neurone durch den Neurotransmitter Glutamat erregt werden, strömen Kalziumionen (Ca 2+) ins Zellinnere und die Ca2+-Oszillationen, also durch die Erregung der Nervenzelle beeinflußt wird. Seit längerem ist ja bekannt, daß Ca2+- und cAMP-regulierte Signalwege einander kontrollieren, zum Beispiel durch die Aktivität von Proteinkinasen (PKC, PKA). die die Signalübertragung in anderen Signalwegen beeinflussen. Unsere Hypothese ist, daß in Nervenzellen der D2 -Rezeptor unter unmittelbarer Kontrolle von Ca2+ steht; der Baustoff, der diese Kontrolle vermittelt, ist das intrazelluläre Ca2+-bindende Protein, Calmodulin. Wir behaupten, daß Ca2+- aktiviertes Calmodulin dem D2 -Rezeptor die aktuelle intrazelluläre Ca2+-Konzentration mitteilt und können zeigen, daß Calmodulin die Signalweitergabe vom D2 -Dopaminrezeptor ans G-Protein hemmt und die rezeptorvermittelte Hemmung der cAMP-Bildung aufhebt. Calmodulin bindet direkt an den rezeptor und zwar an die aminoterminale Hälfte der dritten intrazellulären Peptidschleife, an eine Domäne, die das Aktivierungssignal ans G Protein weitergibt. In dem beantragten Projekt soll erstens die Affinität der Bindung von Calmodulin an den D 2 -Rezeptor und die strukturellen Voraussetzungen der Calmodulinbindung bestimmt werden. Zweitens werden wir untersuchen, ob durch Einführung von "falschen" Aminosäuren die Fähigkeit, das G Protein zu aktivieren bzw. Calmodulin zu binden, dissoziiert werden können oder ob ein und dieselbe Peptidstruktur für beide Eigenschaften verantwortlich ist. Drittens wollen wir an einem neuronalen Zellmodell direkt nachweisen, daß gesteigerte Nervenaktivität mittels Ca2+/Calmodulin die Funktion des D2 -Rezeptors (Steuerung von Ionenströmen) moduliert.

Der D2 -Dopaminrezeptor, Angriffspunkt von Arzneimitteln für die Behandlung von M. Parkinson und der Schizophrenie, hat eine prominente Rolle in der Neuropharmakologie. An der Signalgebung des D 2 -Rezeptors sind neben G-Proteinen zusätzliche zelluläre Proteine beteiligt. In der Vorlaufphase zu diesem Projekt haben wir gezeigt, dass Calmodulin, der zelluläre Calciumsensor, den Rezeptor hemmt und die Signalweitergabe ans G- Protein unterdrückt. Dies legt eine Regelfunktion für Calmodulin nahe, das selbst in seiner Affinität zu Bindungspartnern wie dem D2 -Rezeptor durch Calcium bestimmt wird. Zur Untersuchung der biologischen Rolle der Wechselwirkung mit Calmodulin war es unser Ziel, die Calmodulin-Bindung und die G-Proteinkopplung des Rezeptors zu dissoziieren. Durch Permutation jener Peptidsequenz des Rezeptors, die sowohl für die Calmodulinbindung als auch für die G-Proteinaktivierung verantwortlich ist, soll ein Rezeptor generiert werden, der für Calmodulin blind aber unverändert zur G-Proteinkopplung fähig ist. Untersuchungen an einer Reihe von mutanten Rezeptorpeptiden hat jedoch ergeben, dass die G-Proteinaktivierung - nicht aber die Calmodulinbindung - für den Austausch einzelner Aminosäuren hoch empfindlich ist. Die Eigenschaften der Rezeptor-Peptidfragmente haben wir uns im Weiteren zu Nutze gemacht, um zur Klärung der molekularen Mechanismen der G-Proteinaktivierung beizutragen. Es ist bekannt, dass die Reaktionsschritte, die zur Erkennung des G-Proteins und zu dessen Aktivierung führen, mehr als einen Kontakt mit dem Rezeptor erfordern. Während auf der G-Proteinoberfläche eine Landkarte der Rezeptorkontaktpunkte erstellt werden kann, ist unklar welcher der Kontakte für den eigentlichen Aktivierungsschritt (die Freisetzung von GDP aus der G- Protein-Bindungstasche) verantwortlich ist. Unsere Befunde weisen unzweifelhaft auf die aminoterminale Domäne (etwa 34 Aminosäuren von 330) des G-Proteins hin. Um zu beweisen, dass dieser Proteinanteil tatsächlich als molekularer Schalter ausreicht, muss ein mutantes Protein generiert werden, dessen Aminoterminus von dem des Originals abweicht. Unser nächstes Ziel besteht darin ein N-terminal verkürztes Protein herzustellen und an diesem unsere Hypothese zu prüfen.