DNA Komplexe für verbesserten Import in Zellkerne

Forschungsprojekt P 14289DNA Komplexe für den verbesserten Import in ZellkerneErnst WAGNER06.03.2000 Kernimportsignale für das Einschleusen von DNA in den Zellkern im Rahmen des Rezeptor-vermittelten Gentransfers Nichtviraler Gentransfer wird bereits in klinischen gentherapeutischen Anwendungen getestet. Das Fehlen von effizienten Vektoren verhindert einen wirklichen Durchbruch in der somatischen Gentherapie. Eine Ursache liegt im mangelnden Import von nichtviralen Gentransferpartikeln in den Zellkern (im Gegensatz z.B. zu rekombinanten Adenoviren), wie auch Experimente aus unserer Arbeitsgruppe zeigten. Teilende Zellen können während der Zellteilung die Fremd-DNA passiv in den Kern einschließen. Im. Gegensatz dazu sind bei langsam wachsenden oder nichtteilenden Zellen spezielle Importmechanismen für effizienten Gentransfer nötig. Unser Ziel ist die Entwicklung und Charakterisierung von neuen Gentransfersystemen, die besser in den Kern transportiert werden. Diese neuen Vektoren basieren auf Komplexen aus DNA mit Ligand-Polykation Konjugaten (für Rezeptor vermittelte Aufnahme in die Zelle, Freisetzung aus den Endosomen und Schutz der DNA gegen enzymatischen Abbau), die zusätzlich Elemente für einen verstärkten Kernimport beinhalten. Verschiedene Möglichkeiten der Inkorporierung von Kernimport-Signalen sollen getestet werden. Einerseits werden DNA-Sequenzen verwendet werden, an die zelleigene Proteine mit Kernsignal binden können. Wenn diese Proteine dann in den Kern transportiert werden, sollten sie die Fremd-DNA mitnehmen. Außerdem werden wir verschiedene Kernsignal-Peptide (kurze Aminosäuresequetizen, die in Proteinen das Signal für den Import in den Zellkern darstellen) testen. Einerseits sollen diese Peptide kovalent an die DNA, andererseits an DNA-bindende Adapter-Moleküle gebunden werden. In vitro soll der Gentransfer der neuen Vektoren nicht nur in etablierten Zelllinien, sondern auch in normalen Zellen und in Tumorzellen getestet werden. In vivo (im Mausmodell) soll die Effizienz; bei systemischer Anwendung (zur Therapie von Tumoren) und bei Applikation in die Haut (als Basis für genetische Vakzinierung) untersucht werden.

Nichtvirale Vektoren können meist nur teilende (mitotische`) Zellen effizient transfizieren. Diese Mitose- Abhängigkeit liegt in einer Ineffizienz, die Zellkernbarriere zu überwinden, und stellt eine starke Limitierung für die Gentherapie dar, da viele Zielzellen und Gewebe überwiegend postmitotische Zellen sind. Selbst Tumorzellen teilen sich sich oft relativ langsam. Das Ziel dieser Arbeit war es, nichtvirale Gentransfer-Vektoren mit verbesserten Import in Zellkerne zu entwickeln. Der ursprünglich geplante Einbau von Kernlokalisierungssignalen (SV40 LTA oder M3) in Gentransferkomplexe zeigte keinerlei positiven Effekt auf den Import in den Zellkern. Hingegen gab es positive Resultate mit anderen Prinzipien: zum einen zeigte sich bei der Elektroporation von DNA ein nur kleiner Einfluß der Zellzyklusphase auf die Expression der Reportergene. Egal ob Zellen in der teilenden (mitotischen) Phase oder dem postmitotischen Stadium elektroporiert wurden, war die Expression ungefähr gleich. Zum anderen wurde mit spezielle DNA- Polymer Komplexen (auf Basis von der linearen , nicht-verzweigten Form des Polymers Polyethylenimin) ebenfalls eine hohe Effizienz in der Transfektion nicht-teilender Zellen gefunden. Weiters wurde in Kooperation mit M. Ogris (LMU München) gezeigt, dass der Einbau bestimmte membranaktiver Peptide auf Basis von Melittin sowohl die Freisetzung aus Endosomen als auch überraschenderweise den Kernimport verbessert. In Kooperation mit J. Seipelt wurden Tumorzellen mit neuen Expressionskonstrukten und der entwickelten Gentransfermethodik genmodifiziert. In diesen bicistronischen Expressionskonstrukten wurde die zytotoxische Aktivität der 2A-Protease des humanen Rhinovirus an eine IRES-gesteuerte Expressionskassette des humanen Interleukin-2 Gens gekoppelt. Die toxische Aktivtät der 2A-Protease beruht auf der Abschaltung dier zellulären (aber nicht viralen) Proteinsynthese. Um dennoch gleichzeitig die Expression von Interleukin-2 zu ermöglichen, wurde dieses Gen unter die virale Kontrolle einer internen Ribosomenbindungssequenz des EMC-Virus gestellt. Wie gezeigt werden konnte, können diese Konstrukte so die Expression sowohl der toxischen Protease als auch des immunmodulatorischen Interleukin-2 Gens bewirken. Damit stellt dieser Ansatz ein neues Konzept für mögliche Gentherapien dar.