EWS-FLI1 Zielgene

Forschungsprojekt P 14299EWS-FLI1 ZielgeneHeinrich KOVAR06.03.2000 Bösartige Erkrankungen beim Menschen sind vielfach mit einer Funktionsstörung von Transkriptionsfaktoren assoziiert. Solche Regulatoren kontrollieren das Wachstum, die Differenzierung und den Tod der Zelle, indem sie an spezifische DNS Abschnitte in der Promoterregion von Wachstumsgenen binden und deren Expression modulieren. Der aberrante EWS-FLI1 Transkriptionsfaktor, welcher in Folge einer chromosomalen Translokation spezifisch in Tumoren der Ewing`s Sarkom Familie auftritt, gehört zu einer Familie von Genregulatoren mit ähnlicher DANN-Bindungsspezialität. Es ist unklar, ob die verschiedenen normalen und aberranten Mitglieder dieser Transkriptionsfaktorfamilie überlappende oder unterschiedliche Gengruppen regulieren. In diesem Projekt schlagen wir vor, an EWS-FLI1 gebundene DNS-Fragmente direkt aus Ewing Tumorchromatin nach Kreuzvernetzung zu isolieren. Ausserdem sollten Veränderungen im Genexpressionsprofil von Ewing Tumorzellen verfolgt werden, wenn die EWS-FLI1 Expression induzierbar i) verstärkt, und ii) unterdrückt wird. Diese beiden, einander komplementierenden Ansätze sollten es ermöglichen, EWS-FLI1 regulierte Zielgene im authentischen zellulären Hintergrund zu identifizieren. Zusätzlich sollte es durch das Stadium von verschiedenen EWS-FLI1 Fusionstypen möglich werden, jene Zielgene auszuforschen, deren Expression mit dem klinisch beobachteten unterschiedlichen Krankheitsverlauf von Typ1 versus nicht-Typ 1 EWS-FLI1 exprimierenden Tumoren korrelieren und denen deshalb prognostische Bedeutung zukommt.

In diesem Projekt isolierten wir 99 Gene, welche direkt von dem tumorspezifischen EWS-FLI1 Fusionsprotein in Ewing Tumor (ESFT) Zellen reguliert werden, indem wir erstmals eine Strategie einsetzten, die auf der rein physischen Interaktion des Proteins mit der DNA in-vivo basiert. ESFT stellen eine Familie hoch aggressiver Tumoren dar, welche die Knochen und Weichteile bei Kindern und Jugendlichen befallen. Obwohl ihre Gewebeherkunft unbekannt ist, wird begrenzte nervenartige Differenzierung als Zeichen für einen neuralen Ursprung angesehen. Genetisch sind ESFT durch eine chromosomale Umlagerung charakterisiert, welche zur Bildung des Fusionsgens EWS-FLI1 führt, dessen Produkt an DNA bindet und zu veränderter Genexpression führt. Die gestörte Aktivität EWS-FLI1 regulierter Gene wird für das bösartige Verhalten der Tumorzellen verantwortlich gemacht und so besteht großes Interesse an deren Identifikation als mögliche Ansatzpunkte für neue Therapiekonzepte. Wir optimierten eine Methode zur Ausfällung von in-vivo an EWS-FLI1 gebundener Chromosomen-DNA und nutzten diese Methode, um die enthaltenen Gene in einem hypothesefreien Zugang zu klonieren. Zur funktionellen Bestätigung entwickelten wir eine RNA Interferenzstrategie, die es ermöglichte, die mit einer Modulation der EWS-FLI1 Aktivität verbundenen Veränderungen in der Expression der klonierten Gene zu verfolgen. 99 Gene wurden so identifiziert, von denen etwa ein Drittel ein EWS-FLI1 abhängig verändertes Expressionsmuster in ESFT Zelllinien zeigte. Diese Gene waren ungleichmäßig über das Genom verteilt, viele von Ihnen häuften sich auf den Chromosomen 3 und 8. EWS-FLI1 Bindungsstellen wurden vor allem in regulatorischen Genregionen gefunden. Ein signifikanter Anteil dieser Gene spielt eine Rolle in der Nervenentwicklung, was als Hinweis darauf gewertet werden muss, dass die teilweise neurale Differenzierung von ESFT eine Folge der EWS- FLI1 Genumlagerung und nicht, wie bisher angenommen, eine Eigenschaft der Vorläuferzellen ist. Der Vergleich der Genexpressionsprofile von ESFT und anderen Tumoren des Jugendalters ergab für die meisten der hier isolierten Gene ein ESFT spezifisches Muster. Trotzdem zeigte die Analyse mehrerer ESFT Zelllinien, dass die Bindung von EWS-FLI1 an seine Zielgene für eine veränderte Expression nicht ausreichend ist, und ergab für eine Untergruppe EWS-FLI1 bindender Gene individuelle Variation der Genaktivität. Die Interaktion zwischen EWS- FLI1 und einem Gen der intrazellulären Signalweitergabe wurde im Detail untersucht und die Struktur einer typischen EWS-FLI1 Bindungsstelle definiert. Diese Studie beweist die Möglichkeit der erfolgreichen Anreicherung von Genen, welche mit einem DNA bindenden Protein assoziiert sind, aus dem authentischen zellulären Zusammenhang.