Mechanismus der Beauvericin- und Moniliformintoxizität

Forschungsprojekt P 14507Mechanismus der Beauvericin- und Moniliformin-ToxizitätRosa LEMMENS- GRUBER26.06.2000 Die Schimmelpilze F. subglutinans und F. proliferatum sind die in Österreich am häufigsten auf Getreide vorkommenden Fusarium-Spezies. Sie bilden u.a. die beiden Mykotoxine Beauvericin und Moniliformin über eine durch Beauvericin hervorgerufene Mykotoxikose gibt es kaum Berichte, während Moniliformin ein bekanntes kardiotoxisch wirkendes Mykotoxin ist, die Berichte über die Wirkung bzw. den Wirkungsmechanismus aber sehr widersprüchlich sind. Beauvericin ist ein Cyclodepsipeptid mit zytotoxischen, antibiotischen und insektiziden Eigenschaften, sowie einer starken und spezifischen Hemmung der Cholesterinacyltransferase. Es liegen einige Berichte über eine durch Beauvericin induzierte Zunahme der Ionenpermeabilität für Kalium-, Natrium- und Calciumionen in biologischen Membransystemen vor. Die einzige an Säugetiergewebe durchgeführte Studie weist aber eher auf eine calciumantagonistische Wirkung hin. Ob nun Beauvericin ionophore und/oder calcium- antagonistische Eigenschaften besitzt, ist nicht gek1ärt. Deshalb soll die Wirkung von Beauvericin an isolierten Präparaten und Zellen der glatten Muskulatur und Herzmuskulatur mit elektrophysiologischen Methoden (intrazelluläre Mikroelektrodentechnik, "patch-clamp" Technik) untersucht werden, um den Wirkungsmechanismus aufzuklären. Falls Beauvericin einen Einfluß auf die verschiedenen Parameter des Aktionspotentials hat, dann werden die dafür bestimmenden Ionenströme mit Hilfe der "patch-clamp" Technik genauer untersucht. Sollte sich bestätigen, daß Beauvericin ionophore Eigenschaften besitzt, dann wäre der nächste Schritt die Inkorporation von Beauvericin in Liposomen, um die Ionenselektivität, die Kinetik sowie den Block der Beauvericin-induzierten Poren eingehender untersuchen zu können. Eine Wechselwirkung von Beauvericin mit Calciumionen ist zwar bekannt, der genaue Mechanismus dieser Interaktion könnte mittels "fluorescence imaging" Methode, bei Bedarf in Kombination mit der "patch-clamp" Methode, aufgeklärt werden. Moniliformin ist ein bekanntes kardiotoxisch wirkendes Mykotoxin; der genaue Wirkmechanismus ist jedoch unklar und umstritten. Als Grund für die Zytotoxizität wird eine Hypoxie und ein veränderter Zellmetabolismus angenommen, was zu ultrastrukturellen Schäden mit Degeneration und Nekrose im Herzmuskel führt, da Moniliformin eine Reihe von Enzymen wie die Pyruvatdehydrogenase, Transketolase, Glutathionperoxidase und -reductase sowie die Alaninaminotransferase und die Alkaliphosphatase hemmt oder aktiviert. Von manchen Autoren wurde eine Wirkung auf die Kontraktionskraft und die Spontanaktivität von Herzmuskelpräparaten nachgewiesen; dies konnte jedoch von anderen Arbeitsgruppen nicht bestätigt werden. Ob nun Änderungen der elektrischen Leitfähigkeit im Herzmuskel mit nachfolgender Arrhythmie ausschließlich auf die veränderte Funktion der Enzyme in den Herzzellen zurückzuführen sind oder auch eventuell auf eine direkte Wirkung auf Membranionenströme, ist nicht klar, da widersprüchliche Daten publiziert wurden. Deshalb werden wir Versuche mit Moniliformin mittels elektromechanischer und - physiologischer Techniken durchführen, um zu untersuchen, ob Moniliformin direkt mit Ionenkanälen interagiert oder ob die Kardiotoxizität ausschließlich auf Hypoxie und Enzymhemmung beruht.

Der genaue Wirkungsmechanismus des zytotoxischen Ionophors und antibiotisch wirkenden, sekundären Metaboliten Beauvericin, das von verschiedenen Fusarium Spezies gebildet wird, war nicht geklärt. Die einzigen publizierten Studien von Beauvericin an Säugetierpräparaten wiesen auf eine Calcium-antagonistische Wirkung hin. Dass Moniliformin kardiotoxisch wirkt, ist in mehreren Studien publiziert, allerdings gibt es hier z.T. widersprüchliche Ergebnisse. Da beide Mykotoxine meist gemeinsam auf Getreide-Proben nachzuweisen sind, war es von Interesse die Wirkung der beiden sekundären Metabolite alleine bzw. auch in Kombination auszutesten. Deshalb untersuchten wir die Wirkung von Beauvericin an verschiedenen isolierten Präparaten und Zellen sowie Liposomen hinsichtlich ihrer elektromechanischen und -physiologischen Effekte. Ionophore können entweder über einen Carrier-Mechanismus oder durch Bildung von Poren die Ionenpermeabilität von Membranen verändern. Durch Einzelkanalstromanalysen ("Patch clamp"-Methode in der "inside-out"- Konfiguration) konnten wir zeigen, dass Beauvericin in Zellmembranen und Liposomen inkorporiert und als Kanalbildner fungiert. Durch die Beauvericin-induzierten Poren können mono- und divalente Kationen mit einer Selektivität von K+ > Na+ > Li + >>> Ca2+ > Mg 2+ geleitet werden. Trivalente Kationen blockieren die Beauvericin-induzierte Pore und auch Anionen können nicht geleitet werden. Die Kationenströme unterscheiden sich in ihrer Leitfähigkeit und Kinetik. Durch Vergleich der Leitfähigkeit und Kinetik von Poren in ventrikulären Myozyten und Liposomen konnte festgestellt werden, dass die Kinetik der Beauvericin-induzierten Poren abhängig ist von der Beschaffenheit und Aufbau der Membran. Für den durch Beauvericin gebildeten Kanal konnten sogenannte "Substates" gefunden werden, d.h. ein Kanal kann verschiedene Konfigurationen im geöffneten Zustand annehmen. Aus den elektrophysiologischen Untersuchungen kann die Bildung einer engen Pore aus drei vertikal angeordneten Beauvericin-Molekülen über die Zellmembran angenommen werden. Kationen können entlang des elektrochemischen Gradienten durch diese Poren geleitet werden und führen zu einer initialen Störung des physiologischen Ionen-Gleichgewichts, dem anfänglich durch zelluläre Kompensationsmechanismen entgegengewirkt werden kann. Schließlich kommt es dadurch zu einer Verarmung an ATP führt, zu mitochondrialer Depolarisation und schließlich zu Cytolyse, bedingt durch Calcium-Überladung der Zelle. Für Moniliformin konnten wir in Konzentrationen bis zu 100 M nur geringe elektromechanische Veränderungen sehen, aber keine signifikante Auswirkung auf die elektrophysiologischen Parameter nachweisen. Die Ergebnisse sind von Interesse in Bezug auf die Lebensmittelsicherheit, da Beauvericin und Moniliformin meist gemeinsam als natürlich vorkommende Mykotoxine vor allem auf Getreide nachgewiesen werden. Sie kommen somit in die Futter- und Nahrungsmittelkette und dadurch stellt sich die Frage, ob diese beiden Mykotoxine aus toxikologischer Sicht relevant sind. In den Experimenten an isolierten Zellen bewirkte die kombinierte Applikation der beiden Mykotoxine eine Verstärkung der zytotoxischen Wirkung. Es zeigte sich allerdings auch, dass die Zelle über einen relativ großen Konzentrationsbereich hinweg fähig ist, das Beauvericin-bedingte ÄUngleichgewicht der physiologischen, intrazellulären Ionenkonzentra-tionen zu kompensieren. Da für Beauvericin aufgrund der antibiotischen und antilipidämischen Wirkung auch therapeutische Indikationen diskutiert werden, ist die Kenntnis über den Mechanismus der zytotoxischen Wirkung von Interesse.