Baculoviren als Transportvehikel für tierische Zellen

Forschungsprojekt P 14538Baculoviren als Transportvehikel für tierische ZellenWolfgang ERNST26.06.2000 Baculdviren, hauptsächlich Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, werden seit vielen Jahren zur Produktion verschiedenster rekombinanter Proteine verwendet: Vor einigen Jahren wurde entdeckt, daß Baculdviren auch verschiedene Säugetierzellinien infizieren, und somit ein neues Werkzeug zum Einschleusen von Fremdgenen darstellen. Viruseintritt in humane Hepatocyten, Cos-7, CHO, und andere Zellinien konnte gezeigt werden, sowie auch die Expression geeigneter Reporter-Expressions-Kassetten. Die Verwendung von Baculovieren zur Transduktion von Säugetierzellen bietet den Vorteil eines sicheren Transfervektors und der authentischen Prozessierung eukaryotischer Proteine. Die Hauptaufgabe dieses Projektes ist es, die Effizienz des viralen Eintritt in Säugetierzellen zu erhöhen, sodaß niedrigere infektiöse Virus-Titer ausreichen. Zur Zeit werden mois (multiplicities of infection) von 200 benötigt um effiziente Transduktion tierischer Zellen zu erreichen, dies aber ist für Medium- oder Large-Scale-Produktion das größte Hindernis. Während der letzten Jahre gelang es uns, ein Baculovirus-Surface-Display System zu etablieren, welches uns erlaubt die Virusoberfläche durch Fusionen rekombinanter Proteine an das Major Coat gp64, spezifisch zu verändern. Weiters konnten wir zeigen, daß eine direkte Modifikation des nativen gp64 durch Insertion von Petipiden möglich ist. Mit Hilfe dieses Werkzeuges und der Tatsachem daß die viralen Oberfächenstrukturen für den Eintritt in die Zelle verantwortlich ist, planen wir, spezifische Liganden in die Virusoberfläche einzubauen, die einen Durchtritt durch die Zellmembran bewirken, beziehungsweise erleichtern. Das Aminosäure-Motiv RGD zum Beispiel, ist ein spezifischer Ligand für viele Integrine, welche sich an der zellulären Oberfläche befinden. Adenovirus und Coxsackievirus benützen diese Strategie um in ihre Wirtszellen einzudringen. Auch Polypeptide, wie das HIV- I codiert Tat-Protein oder ein Drosophila kodierter Transkriptionsfaktor (Ant-p) besitzen die Fähigkeiten Zellmembranen zu durchdringen und können als Translokations-Vehike1 verwendet werden. Durch Einbau solcher Peptide in geeignete und gut zugängliche Stellen im gp64, hoffen wir, virale Transduktionsraten drastisch zu erhöhen, und somit benötigte mois zu senken. Während dieses Projektes soll eine neue Strategie zur transienten Expression in Säugetierzellen (z.B. CHO) etabliert werden, aber auch Zellinien transduzierbar gemacht werden, die bis jetzt resistent gegen den Eintritt von Baculoviren waren.

Kürzlich wurden Baculoviren als alternative Methode für den Gentranfer in tierische Zellen entdeckt. Im Vergleich zu anderen viralen Vektorsystemen bieten sie den Vorteil hoher Sicherheit und besitzen keine zelltoxischen Effekte für die Zielzelle. Aufgabe des Projektes war die Implementierung und Verbesserung des Baculovirussystems zum Zweck der Effizienzsteigerung der Geneinschleusung in tierische Zellen. Die Überlegung für die Schaffung solcher verbesserter Vektoren gründet sich auf spezifische Änderung der Oberfläche des Wildtypvirus. Oberflächen- modifizierte Baculoviren wurden bereits verwendet zur Darstellung von Fremd-Proteinen, zur Ligandensuche aus Oberflächen-Expressionslibraries und zur Untersuchung von Proteinfunktionen. Die von uns entwickelte Technologie erlaubt eine direkte Veränderung der Virusoberfläche durch Modifikation des viralen Hüllproteins gp64, und zwar jeder einzelnen Kopie, was in sehr hoher Anzahl der gewünschten Zielsequenz resultiert. Basierend auf dieser Methode und der Tatsache, daß Oberflächeneigenschaften für das Eindringen von Viren verantwortlich sind, wurden verschiedene fremde Bindungsliganden eingefügt, welche für Virus-Rezeptorbindung und Eintritt in die Zielzelle bekannt sind. Zunächst versuchten wir die optimale Position für den Liganden innerhalb der gp64 Struktur zu bestimmen. Dabei mußten wir bestmögliche Präsentationseigenschaften für den Liganden erreichen, ohne die funktionale Integrität des Hüllproteins zu beeinflussen. Mittels mathematischer Vorhersagemodelle wählten wir mehrere Positionen mit hoher Oberflächenwahrscheinlichkeit, die in praktischen Experimenten auf ihre Eignung getestet wurden. Die Bindungsstelle eines Modellantikörpers (6 Aminosäuren) wurde an diesen Positionen eingefügt, wobei die Antigen-Antikörper Wechselwirkung herangezogen wurde, um die Signalintensität der verschiedenen Mutanten zu messen. Aufgrund der Ergebnisse dieser Analysen erwarteten wir von Aminosäureposition 274 und 283 im gp64 Baculovirus Hüllprotein das beste Präsentationspotential für den gewünschten Liganden. Folglich konstruierten wir zwei verschiedene Bindungsliganden in diese beiden Positionen, eine 23 Aminosäure lange Sequenz des Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV) und eine synthetische Sequenz, die ebenfalls das Aminosäuremotiv Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) beinhaltet, sowie den funktionellen Teil (11 Aminosäuren) der Protein-Einschleusungsdomäne des HIV "tat" Proteins. Die Funktionalität der eingefügten Sequenzen konnte anhand spezifischer Bindung der RGD-Viren an ihren Zielrezeptor Integrin in einem Festphasen-Bindungstest gezeigt werden. Das "tat" Peptid wurde als Beispiel für Rezeptor unabhängige Einschleusung gewählt. Die Einschleusungseffizienz der Konstrukte AcFMDV283 und AcTAT283 wurde durch Bestimmung der Expressionsstärke eines Testgens in verschiedenen tierischen Zellinien getestet. In BHK-21 Hamsterzellen konnten wir eine mehr als 2-fache Erhöhung der Testgen-Expression bei Virusmutante AcFMDV283 beobachten. In chinesischen Hamsterzellen (CHO) bewirkten die Virusmutanten AcFMDV283 eine 4-fach erhöhte, und AcTAT283 eine 10-fach höhere Testgen-Expression. Unsere Ergebnisse zeigten, daß durch Einfügung der FMDV-Sequenz und der HIV "tat" Sequenz in das Baculovirushüllprotein gp64 eine Virusoberfläche mit den erwünschten Eigenschaften entstand, die zu erhöhter Aufnahme der Baculoviruspartikel in tierische Zellen genützt werden kann.