Wechselwirkungen ribosomaler Proteine mit rRNA und mRNA

Forschungsprojekt P 14550Wechselwirkungen ribosomaler Proteine mit rRNA und mRNAWolfgang PIENDL26.06.2000 Wechselwirkungen zwischen ribosomalen Proteinen mit ihren spezifischen Bindestellen auf der rRNA und mRNA: Strukturelemente, die die Affinität beider Partner zueinander modulieren Im Rahmen des Vorläuferprojekts, wurde die Regulation der Synthese ribosomaler Protein in Archaea (früher als Archaebakterien bezeichnet) am Beispiel des MvaLl-Operons, von Methanococcus vannielii, das die ribosomalen Proteine LI, LIO und L12 codiert, untersucht. LI fungiert als translationeller Repressor seines Operons. Es bindet an eine Struktur an der eigenen mRNA, die der primären Bindestelle an der ribosomalen 23S RNA stark ähnelt, mit etwa zehnfach niedriger Affinität als an die 23S rRNA-Bindestelle und inhibiert so die eigene, Translation. Ähnliche Untersuchungen an der eng verwandten, hyperthermophilen Art Methanococcus jannaschii (optimale Wachstums-Temperatur 85C) hatten überraschenderweise gezeigt, daß die Affinität von LI für die spezifische Bindestelle an der 23S rRNA und an der mRNA jeweils um mindestens eine Größenordnung höher ist als die von LI aus mesophilen Arten. Das Hauptziel dieses neuen Projekts ist die Untersuchung der Wechselwirkungen der ribosomalen Proteine, L1, S8 und des pentameren Komplexes LIO/L12(4) mit ihren spezifischen RNA-Bindestellen. Die Proteine aus mesophilen und hyperthermophilen Methanococcus-Arten sind ein ideales Modell-System für diese Untersuchungen, da sie sehr ähnlich sind (~ 80% identische Aminosäuren), aber deutlich unterschiedliche Affinitäten für die spezifischen RNA-Bindestellen aufweisen. Die Basen und die Aminosäuren, die direkt in die RNA-Protein-Komplexbildung involviert sind, sind bei hoch-affinen und niedrig-affinen Komplexen identisch und auch gut charakterisiert. Unsere Untersuchungen werden sich hauptsächlich auf die Identifizierung und Charakterisierung jener Struktur-Elemente konzentrieren, die diese niedere oder hohe Affinität der homologen mesophilen und thermophilen Proteine zur spezifischen RNA-Bindestelle bestimmen. Ebenso sollen die strukturellen Komponenten der LI-Bindestellen an der RNA untersucht werden, die diese als hoch-affine (23S RNA) bzw. als niedrig-affine (mRNA) Bindestelle definieren. Unsere Untersuchungen sollen zum generellen Verständnis von RNA-Protein-Wechselwirkungen beitragen, die nicht nur bei der Genese und Funktion von Ribosomen, sondern auch bei vielen anderen biologischen Prozessen wie Differenzierung und Entwicklung oder auch bei der Regulation der Gen-Expression eine zentrale Rolle spielen.

Die wichtigsten Ergebnisse, die im Rahmen dieses Projekts erzielt wurden, sind: Die Aufklärung der Struktur der L1-Protuberance des Ribosoms. In Zusammenarbeit mit einer russischen Gruppe konnte die Kristall-Struktur des ribosomalen Proteins L1 (aus dem Archaeon Sulfolobus acidocaldariius) in Komplex mit seiner spezifischen Bindestelle an der ribosomalen 23S RNA geklärt werden. Somit konnte die vorletzte große Lücke in der Struktur des Ribosoms geschlossen werden. Die Aufklärung der Struktur des regulatorischen L1-mRNA-Komplexes. In Bakterien und Archaea reguliert das ribosomale Protein L1 seine eigene (und die der auf der gleichen Transkriptionseinheit codierten ribosomalen Proteine) Synthese , indem es, wenn im Überschuss synthetisiert, an die eigene mRNA bindet und somit die Synthese aller auf dem Operon codierten Proteine hemmt. L1 bindet an eine Struktur an der eigenen mRNA, die der primären Bindestelle an der 23S rRNA stark ähnelt, mit etwa zehnfach niedriger Affinität als an die primäre 23S rRNA-Bindestelle. In Zusammenarbeit mit den russischen Partnern gelang die Aufklärung der Kristallstruktur des Komplexes aus L1 und mRNA. Der Strukturvergleich mit dem L1-rRNA-Komplex zeigt, dass eine geringere Anzahl von H-Brücken, die in die Interaktion von rRNA und mRNA mit L1 involviert sind, für den Unterschied in der Affinität für L1 verantwortlich sind. Ribosomale Proteine aus (hyper)thermophilen Organismen binden RNA mit extrem hoher Affinität. Am Beispiel der primär rRNA bindenden ribosomalen Proteine S8 und L10 (als L10/L124 -Komplex) konnten wir zeigen, dass die Proteine aus thermophilen Organismen (optimale Wachstumstemperatur bis 75C) die spezifischen rRNA- Bindestellen 10fach stärker und die aus hyperthermophilen Organismen (optimale Wachstumstemperatur über 75C) 100fach stärker binden als die homologen Proteine aus eng verwandten mesophilen Organismen. Wir vermuten, dass die Stabilität der einzelnen rRNA-Protein-Komplexe im Ribosom die Stabilität des gesamten Ribosoms moduliert und somit ein Maximum an Thermostabilität und Flexibilität im Bereich der optimalen Wachstumstemperatur der Organismen verleiht, das für eine optimale Protein-Biosynthese im jeweiligen Temperaturbereich benötigt wird. Unsere Untersuchungen sollen zum generellen Verständnis von RNA-Protein-Wechselwirkungen beitragen, die nicht nur bei der Genese und Funktion von Ribosomen, sondern auch bei vielen anderen biologischen Prozessen wie Differenzierung und Entwicklung oder auch bei der Regulation der Gen-Expression eine zentrale Rolle spielen.