Metallothionein-Isoformen in terrestrischen Gastropoden

Forschungsprojekt P 14593Metallothioein-Isoformen in terrestrischen GastropodenReinhard DALLINGER09.10.2000 Metallothioneine (MTs) sind hydrophile, niedermolekulare Proteine mit einer hohen Bindungsaffinität zu gewissen Spurenelement-Ionen, wie Cd2+, Zn2+ und Cu+ . Die Hauptfunktion dieser Proteine stellt offenbar im Zusammenhang mit dem zellulären Spurenelement-Stoffwechsel, und es gilt mittlerweile als erwiesen, daß MTs eine wesentliche Rolle bei der Entgiftung toxischer Metallionen (wie z.B. Cd2+), sowie bei der Hornöostase essentieller Spurenelement-Ionen (Zn 2+ und Cu+ ) spielen. Während der vergangenen Jahre konnten neue und interessante Erkenntnisse im Zusammenhang mit der Struktur und Funktion von MTs bei terrestrischen Invertebraten gewonnen werden. Die MTs dieser Organismen zeichnen sich durch ihre große strukturelle Vielfalt aus. Dieser Umstand eröffnet interessante Perspektiven in Hinblick auf die Formulierung neuer Hypothesen zur Struktur und Funktion von MTs. Ein Beispiel dafür stellt das Funktionsmodell der MTs bei terrestrischen Gastropoden dar. In dieser Tiergruppe konnten zwei strukturell stark voneinander abweichende MT-Isoformen entdeckt werden, die offenbar unterschiedliche, Metall- spezifische Funktionen ausüben: Die eine Isoform kommt in der Mitteldarmdrüse von Schnecken vor und dient offensichtlich der Entgiftung des toxischen Cd2+-Ions; demgegenüber findet sich im Mantel der Tiere eine zweite, Cu-spezifische Isoform, die offenbar der Kupferregulation dient (siehe dazu Dallinger et al. 1997, Nature 388, 237-238). Allerdings sind die spezifischen Bedingungen, die es den beiden Isoformen ermöglichen, Metall-spezifischen Funktionen nachzugehen, noch weitgehend unbekannt. Das Ziel des vorliegenden Projektes ist es daher, diese Fragen aufzugreifen und anhand von vier naheliegenden Arbeitshypothesen zu überprüfen. Erste Arbeitshypothese: Funktionsspezifische Unterschiede zwischen den beiden MT-Isoformen in Bezug auf den Stoffwechsel von Cd2+ und Cu+ können auf Unterschiede in ihrer Genstruktur und daher auf unterschiedliche, molekulare Regulationsmechanismen zurückgeführt werden. Um diese Arbeitshypothese zu testen, sollen die Genstruktur der beiden Isoformen und die regulatorischen Elemente in der Promotor-Region aufgeklärt werden. Methodisch soll dies durch verschiedene. PCR-Ansätze erreicht werden, die an der bereits bekannten Sequenz der cDNA der beiden Isoformen anknüpfen. Insbesondere eignen sich dazu die sogenannte ,,Long-Distance PCR", sowie modifizierte Ansätze einer "inversen PCR" und einer "Tail-PCR". Darüberhinaus soll die Expression der beiden MT-Isoformen auf molekularer Ebene mit Hilfe der quantitativen PCR, auf Protein-Ebene mit Hilfe Metall- spezifischer Sättigungs-Verfahren quantifiziert werden. Zweite Arbeitshypothese: Unterschiede in der Metall-Präferenz zwischen den beiden MT-Isoformen lassen sich auf Unterschiede in ihrer Primärstruktur zurückführen. Die Überprüfung dieser zweiten Hypothese erfordert eine möglichst hohe Ausbeute der beiden Isoformen auf Protein-Ebene, weshalb an die rekombinante Expression der beiden Isoformen mit Hilfe eines bakteriellen Expressions-Systems gedacht ist. Die dabei gewonnen Peptide sollen in Hinblick auf ihre wichtigsten biophysikalischen, biochemischen und strukturellen Eigenschaften miteinander verglichen werden. Dabei sollen unterschiedliche Methoden zum Einsatz kommen, wie etwa Titrations- Kalozimetrie, UV- und Polarisations-Spektrophotometrie, Elekuospray-Ionisations-Massenspektrometrie, sowie NMR anhand einer mit dein Isotop 113 Cd angereicherten Isoform. Als Perspektive für die Zukunft ist auch an Versuche gedacht, bei denen durch Aminosäurenaustäusche mit Hilfe der "Splicing by Overlap Extension" (SOE) PCR Protein-Chimären synthetisiert werden sollen, um mögliche Funktions-Übergänge von einer Cd-dominierten Isoform zu einem Cu-dominierten Peptid nachzuvollziehen. Dritte Arbeitshypothese: Die Metall-Spezifität der beiden Isoformen in vivo beruht auf zellulären und Gewebe- spezifischen Diskriminierungsmechanismen, wobei insbesondere an differentielle Expressionsmuster der beiden Isoformen in unterschiedlichen Zellen und Geweben der Schnecke gedacht ist. Die Überprüfung dieser Hypothese soll anhand zweier unterschiedlicher histochemischer Verfahren erfolgen, bei denen die beiden Isoformen in spezifischer Weise einmal mit Hilfe polyklonaler Antikörper, zum anderen anhand einer In-sttu Hybridisierung der jeweiligen mRNA sichtbar gemacht werden sollen. Vierte Arbeitshypothese: Für ein besseres Verständnis der Metall-spezifischen Funktion der beiden Isoformen muß deren Wechselwirkung mit anderen, Metall bindenden Molekülen im Gewebe der Schnecken betrachtet werden. Dazu sollen drei mögliche Wechselwirkungen überprüft werden: 1) Die Interaktion mit anderen, bisher noch unbekannten MT-Isoformen, deren Existenz aufgrund bisheriger Versuche als wahrscheinlich gilt; 2) die Rolle des Glutathions im Zusammenhang mit der Bindung von Zn2+, sowie dessen Wechselwirkung mit einer hypothetischen, Zn-bindenden MT-Isoform; und 3) die äußerst spannende und von uns bereits vermutete Wechselwirkung der Cu-bindenden MT-Isoform mit dem Cu-bindenden Blutfarbstoff Hämocyanin, wobei insbesondere deren Donor-Funktion für Cu+ -Ionen an das Hämocyanin im Mittelpunkt des Interesses stehen soll. Wir sind davon überzeugt, daß unser Modell der metall-spezifischen Funktion zweier MT-Isoformen bei terrestrischen Gastropoden weit über eine art-spezifische Bedeutung hinausgeht und von allgemeinem biologischem Interesse ist. Zur besseren Erreichung unserer Projektziele arbeiten wir mit international renommierten Experten zusammen.

Terrestrische Schnecken aus der Familie der Heliciden (wie z.B. unsere Weinbergschnecke, Helix pomatia) besitzen die Fähigkeit, gewisse metallische, nicht-essentielle Spurenelemente (Cd) in außerordentlich starkem Maß in ihren Geweben anzureichern und dabei gleichzeitig die Regulation essentieller Spurenelemente (Cu) aufrecht zu erhalten. Die Tiere bewerkstelligen dies dank der spezifischen Wirkung zweier Metall-spezifischer Metallothionein-Isoformen (MT-Isoformen), von denen die eine vorwiegend für die Cd-Entgiftung zuständig ist, während die zweite vor allem der homöostatischen Cu-Regulation dient. Das Ziel des vorliegenden Projektes war es, die molekularen, strukturellen, zellulären und physiologischen Grundlagen für die Metall-spezifische Funktion der beiden Isoformen zu untersuchen und besser verstehen zu lernen. Ausgangspunkt für die Untersuchung waren vier Arbeitshypothesen, die im Verlauf der Projektarbeit geprüft und allenfalls verifiziert werden sollten. Die erste Hypothese ging davon aus, dass die Metall-spezifische Funktion der beiden Isoformen letztlich auf die Struktur und die regulatorische Aktivität der beiden zugehörigen Gene zurückzuführen ist. Die Untersuchungen zeigten, dass diese Hypothese zum Teil zutrifft: Das Gen der Cd-spezifischen Isoform kann durch Einwirkung von Cd induziert werden. Dies bedeutet, dass die entsprechende, Cd-bindende Isoform immer dann mit erhöhter Rate synthetisiert wird, wenn die Tiere dem toxischen Metall ausgesetzt sind. Es zeigte sich, dass die Grundlage für diese Induktion aus der Genstruktur heraus erklärt werden kann, wobei mehrere Metall-responsive Regulationselemente in der Nukleotidsequenz für die Induktion verantwortlich sind. Darüberhinaus zeigte sich, dass das für das Cd-MT codierende Gen noch zahlreiche andere regulatorische Elemente besitzt, die vermuten lassen, dass eine Induktion des Proteins auch durch andere Stressfaktoren (Hitze, physiologischer Stress) im Zusammenhang mit dem Mineralhaushalt und der Reproduktion der Tiere ausgelöst werden könnte. Anhand der zweiten Arbeitshypothese sollte geprüft werden, ob und inwieweit die Metall-spezifischen Eigenschaften der beiden Isoformen durch ihre Peptidstruktur erklärbar sind. Dabei konnte gezeigt werden, dass die unterschiedliche Spezifität und Stöchiometrie der beiden Isoformen für Cd und Cu, sowie zahlreiche ihrer sonstigen, divergierenden biochemischen Eigenschaften auf Unterschieden in der Primärstruktur der beiden Isoformen begründet sind. Die dritte Hypothese ging davon aus, dass die Metall-spezifische Funktionen, die die beiden MT-Isoformen im Zellstoffwechsel erfüllen, durch zelluläre Mechanismen determiniert oder zumindest modifizierbar sind. Auch diese Hypothese konnte verifiziert werden, wobei mit Hilfe molekularer Methoden gezeigt werden konnte, dass das die Cd-spezifische MT-Isoform vor allem in Geweben und Epithelien des Verdaungstraktes und der Verdauungsdrüsen exprimiert wird. Dort dient sie offenbar vorwiegend der Inaktivierung des über die Nahrung aufgenommenen Cd. Im Gegensatz dazu wird die Cu-spezifische MT-Isoform ausschließlich in einem einzigen Zelltypus exprimiert, der als Rhogocyt bezeichnet wird. Da diese Isoform jedoch keineswegs durch Metallexposition induziert werden kann, muss angenommen werden, dass ihr dort eine physiologisch-regulatorische Funktion zukommt, die nichts mit einem allfälligen Metall-Stress zu tun hat. Vielmehr sind dafür eigene Kupfer-Speicher in den Rhogocyten in Form von Cu-gefüllten Granula zuständig, deren Bildung und Dichte von einer allfälligen Cu-Exposition abhängig ist. Die vierte und letzte Hyphothese ging davon aus, dass die Funktion der beiden Metall-spezifischen Isoformen nur im zellulären Kontext mit anderen Metall-Liganden und Metall-Speichern verstanden werden kann. In diesem Zusammenhang konnte zusätzlich zur Cu-spezifischen MT-Isoform in den Rhogocyten eine ein Cu-Transport- Protein entdeckt werden, dessen Struktur zur Zeit gerade aufgeklärt wird.