Regulation IGFBP-3 abhängiger Apoptose durch HPV-16E7

Humane Papillomviren (HPV) der "high-risk"-Gruppe sind die ätiologischen Faktoren für die Entstehung des Zervixkarzinoms und anderer anogenitaler Karzinome. Insbesondere HPV 16 und 18 zeichnen sich durch eine starke Assoziation mit schweren intraepithelialen Neoplasien und Zervixkarzinomen aus. E7 ist das am stärksten transformierende Onkoprotein der "high-risk"-HPVs. Nach der aktuellen Hypothese muss E7 mehrere antiproliferative Signalwege deregulieren, um humane Epithelzellen zu immortalisieren. Dementsprechend wurde gezeigt, dass E7 an verschiedene, das Wachstum kontrollierende, zelluläre Regulatorproteine binden und diese funktionell modulieren kann. Ein solches E7-Zielprotein ist "Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3" (IGFBP-3), ein Mitglied der IGF-Achse wachstumsregulierender Proteine, welches sowohl als extrazelluläres als auch intrazelluläres, kernständiges Protein vorkommt. Es wird angenommen, dass beide IGFBP-3-Formen Apoptose auslösen können. Die dafür zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nur wenig verstanden. IGFBP-3-abhängige Apoptose kann durch E7 blockiert werden, welches direkt mit IGFBP-3 interagiert und dessen proteolytische Degradation induziert. Ziel dieses Antrages ist es, die Regulation der IGFBP-3 induzierten Apoptose durch E7 besser zu verstehen. Um zwischen proapoptotischen Effekten durch extra- und intrazelluläres IGFBP-3 unterscheiden zu können, ist geplant, die sekretorische Signalsequenz in IGFBP-3 zu deletieren. So soll eine nicht sekretierbare und damit intrazelluläre Form von IGFBP-3 (IGFBP-3DS) generiert werden. Wenn ektopisch exprimiertes IGFBP-3DS Apoptose induzieren kann, wollen wir die strukturellen Determinanten in IGFBP-3 bestimmen, die für diese Aktivität notwendig sind. Ferner soll durch die Verwendung einer IGFBP-3-Mutante, die nicht mehr in den Zellkern transportiert werden kann, geklärt werden, ob die Lokalisation von IGFBP-3 im Zellkern eine Rolle bei der IGFBP-3-abhängigen Apoptose spielt. Anschließend wollen wir den Einfluss von E7 auf die proapoptotische Aktivität von IGFBP-3DS untersuchen. Als weiteres Ziel ist geplant, den molekularen Mechanismus der proteolytischen Degradation von IGFBP-3 zu untersuchen. Dazu soll getestet werden, ob IGFBP- 3 polyubiquitiniert werden kann, und ob diese Modifikation für den Proteasome-abhängigen Abbau von IGFBP-3 notwendig ist. Wenn dies der Fall ist, wollen wir die Sequenzen bestimmen, die notwendig und ausreichend für eine Ubiquitin-Proteasome-abhängige Degradation von IGFBP-3 sind. Schließlich soll geklärt werden, ob Multiubiquitinierung eine Rolle bei der durch E7 induzierten Proteolyse von IGFBP-3 spielt.

Humane Papillomviren (HPV) der "high-risk"-Gruppe sind der hauptsächliche ätiologische Faktor für das Zervixkarzinom (Gebährmutterhalskrebs). Insbesondere der "high-risk"-Genotyp HPV 16 zeichnet sich durch die häufige Assoziation mit schweren intraepithelialen Neoplasien und Zervixkarzinomen aus. E7 ist das hauptsächliche Onkoprotein der "high-risk"-HPVs. Nach dem derzeitigen Stand der Forschung ist E7 ein multifunktionelles Protein, dass verschiedene Kontrollmechanismen der Proliferation, Apoptose und Differenzierung dereguliert und so humane Epithelzellen immortalisieren kann. Dabei interagiert E7 mit zellulären Regulatorproteinen und moduliert diese in ihrer Funktion. Ein solches E7-Zielprotein ist "Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3" (IGFBP-3), ein Mitglied der IGF-Achse Wachstumsregulierender Proteine, welches sowohl als extrazelluläres als auch intrazelluläres Protein vorkommt. Es wird angenommen, dass beide IGFBP-3- Formen Apoptose auslösen können, wie das genau gesteuert wird ist jedoch nicht bekannt. In diesem Projekt wurden wichtige wissenschaftliche Fortschritte für das Verständnis der Mechanismen erzielt die der Steuerung der IGFBP-3-Aktivität unterliegen. Wir konnten erstmals zeigen, dass die Stabilität von kernständigen IGFBP-3 durch Polyubiquitinierung und anschließender proteasom-abhängiger Proteolyse kontrolliert wird. Ferner wurde gezeigt, dass kernständiges IGFBP-3 eine proapoptotische Aktivität besitzt. Die Ubiquitin/Proteasom-abhängige Proteolyse von IGFBP-3 im Kern trägt sehr wahrscheinlich zur Regulation der IGFBP-3-induzierten Apoptose bei. Es war bekannt, dass IGFBP-3-abhängige Apoptose durch E7 blockiert werden kann, indem das virale Onkoprotein an IGFBP-3 bindet und dessen Proteolyse induziert. Der zugrunde liegende Mechanismus war aber nur wenig verstanden. Wir haben gefunden, dass E7 mit IGFBP-3 im Zellkern interagiert und dessen Polyubiquitinierung und proteasom-abhängige Proteolyse stark beschleunigt, was zu einer dramatischen Reduktion der Halbwertzeit von IGFBP-3 führt. Das trägt sehr wahrscheinlich zur Regulation der apoptotischen Aktivität von IGFBP-3 im Zellkern bei. Schließlich konnten wir im Laufe dieses Projektes, durch die Entwicklung von hochspezifischen Anti-HPV-16 E7 Antikörpern erstmals in Zervixbiopsien zeigen, dass die Levels des HPV-16 E7 Onkoproteins während der Zervixkarzinogenese stark ansteigen. Das unterstreicht die wichtige Rolle des E7 Onkoproteins für Gebährmutterhalskrebs. Wir haben die E7-Levels mit denen von IGFBP-3 verglichen und in 47 von 47 Zervixkarzinomen gefunden, dass die intrazellulären E7-Levels invers mit den IGFBP-3 Levels korrelieren. IGFBP-3 ist in den Basalzellen des normalen zervikalen Plattenepithels exprimiert, wir haben aber in keinem der HPV-16 E7 Protein positiven Zervixkarzinome IGFBP-3 nachweisen können. Diese Befunde weisen darauf hin, dass E7 die Proteolyse von IGFBP-3 wahrscheinlich auch in vivo induziert.