Cyr61 Gen-knockout in Mäusen

Das Cyr61 Protein ist ein Teil der kürzlich identifizierten CCN Angiogeneseregulator-Familie. Dieser Familie segregierter Proteine werden 6 Proteine zugerechnet: Cyr61, CTGF, Nov; WISP-1, WISP-2 und WISP-3. Diese strukturell konservierten Proteine beinhalten 4 moduläre Domänen, die in ihrer Sequenz den insulin-like growth factor-bindenden Proteinen von Willebrand Faktor Type C Repeat, Thrombospondin Type 1 Repeat und Growth Faktor Cysteine-Knots ähnlich sind. Für Cyr61 kodiert ein immediate early gene, in Fibroblasten wird es durch die Serumfaktoren, bFGF, PDGF und TGF-ß1 co-induziert. Das Protein bindet an Heparin und ist an die extrazelluläre Matrix assoziiert. In reiner Form vermittelt Cyr61 Zelladhäsion, stimuliert die Zellmigration und erhöht die durch Wachstumsfaktoren induzierte DNA-Synthese. In Vitro, fördert Cyr61 die chondrogene Differenzierung, was im Einklang mit seiner Expression im prächondrogenen Mesenchym während der Embryonalentwicklung steht. Es stimuliert die Chemotaxis in endothelialen Zellen durch Integrin a v ß 3 -abhängige Reaktionswege. In Vivo induziert es die Angiogenese und Vaskularisation. Die Expression von Cyr61 in Tumorzellen erhöht deren Tumorgenität indem es zu verstärkter Vaskularisierung und Tumorwachstum führt. Außerdem wurde Cyr61 auch in Granulationsgewebe während der Wundheilung in der Haut nachgewiesen. Bis heute wurden allerdings noch keine gezielten Gen-Knockout Studien von Proteinen der CCN-Familie veröffentlicht. Da es sehr wahrscheinlich ist, dass ein "klassischer" Cyr61 Knockout embryonale Lethalität zur Folge haben könnte, streben wir einen sog. "konditionellen" Knockout an, der es uns erlauben wird die Cyr61 Expression selektiv, in einzelnen Geweben und in verschiedenen ontogenetischen Stadien auszuschalten. Bisher wurde dafür das Cyr61 Gen isoliert, weitgehend charakterisiert und ein Targeting Vektor für die konditionelle Cyr61 Ausschaltung vorbereitet. Außerdem wurde darin in-vitro die für den Versuch unabdingbare Funktion des Cre-loxP Systems nachgewiesen. Dieser Targeting Vektor wird für die Elektroporation von R1 embryonalen Stammzellen verwendet werden. Die korrekten homologen rekombinanten Klone werden dann verwendet um Cyr61 defiziente Mäuse zu erhalten. Die homo und heterozygoten Tiere werden mit Mäusen aus anderen transgenen Linien gekreuzt werden. Erstens mit Mäusen, die in speziellen Geweben das Cre-Protein unter Kontrolle eines Tie-1 Promoters exprimieren, zweitens mit Mäusen, die das Cre-Protein nach Induktion durch 4-hydroxytamoxifen ubiquitär exprimieren, und daher Cyr-61 in diesen Geweben, die das Cre-Protein exprimieren, ausschalten. Die erfolgreiche Annahme des vorgelegten Projektes wird dazu beitragen, die Rolle von Cyr61 in Säugern weiter aufzuklären, insbesondere die bereits vorgeschlagenen Einflüsse des Cyr61 auf die embryonale Entwicklung, die Chondrogenese, die Vaskulogenese und auch eine mögliche Rolle im Rahmen der kutanen Wundheilung und der Tumorgenese weiter erforschen zu können.

Die Verwendung von gentechnisch veränderten Tieren hat in den letzten Jahren unser Wissen im Bereich der Gen- Regulierungen, Entwicklung von Säugetieren und der menschlichen Krankheiten erweitert. Durch die Verwendung embryonaler Stammzellen-Technologie (ES) wurde es möglich, spezifische Gene in Mäusen zu deaktivieren, welche relevante Informationen über diese Gene preisgeben. Da manche von diesen Gene-Deaktivirungen die embryonale Sterblichkeit verursachen, können wir keine Informationen über die Funktion dieser Gene in adulten Tieren erhalten. Das gilt völlig für das Cyr61-Gen, wobei Cyr61-deaktivierte Mäuse an verringerter Blutgefäßen- Integrität und unzureichender Funktion der Plazenta im embryonalen Stadium starben. Um die Funktion von Cyr61 nach der Geburt aufzudecken, erzeugten wir Mäuse mit bedingter Cyr61- Deaktivierung, was uns ermöglichte das Cyr61 Gen erst nach der Geburt zu deaktivieren. Um das zu erreichen, klonten wir das Cyr61-Gen und generierten einen sogenannten "Deaktivierungs Vector". Durch die Einführung dieses Vektors in die ES-Zellen mittels Elektroporation wurde das endogene Cyr61-Gen durch das fast identische Cyr61-Gen, welches sich ausschließlich durch die Anwesenheit von "loxP-Stellen" unterschied, ersetzt. In den Zellen, in denen das Cre-Protein anwesend ist, werden die loxP-Stellen erkannt und die angrenzenden Sequenzen gelöscht. Wir vereinten solche modifizierten ES-Zellen mit Embryonen von Wild-Typ Muttertieren und transferierten sie in hormonell vorbereitete Muttertiere. Daher erhielten wir mehrere chimere Mäuse, die solche genetische Informationen an ihre Nachkommen weitergeben konnten. Diese Mäuse wurden anschließend mit transgenen Mäusen, die durch Einwirkung von 4-Hydroxytamoxifen das Cre Protein erzeugen, gekreuzt. Die Entwicklung von doppeltransgenen Mäusen war normal, doch 4-Hydroxytamoxifen führte zu einer Cyr61-Deaktivierung nach der Geburt, was uns erlaubte die Funktion dieses Gens näher zu erforschen. Wir konnten zeigen, dass Cyr61 eine wichtige Rolle in der Wundheilung spielt und dass die Deaktivierung dises Gens zu einer Verlängerung dieses Prozesses führt. Weitere Analysen sollten die Funktion von Cyr61 betreffend die Erzeugung neuer Blutgefäßen in Mäusen nach der Geburt aufdecken, sowie in der Restenose und weiblicher Fortpflanzung. Diese Studien werden gerade durchgeführt und werden nach Abschluß in das Projekt eingebunden. Nachdem viele physiologische Prozesse in Mäusen und Menschen gleich sind, können wir damit Rückschlüsse über die physiologische Rolle des Cyr61 Gen auf den Menschen treffen.