Arabidopsis Mutanten der RNA-vermittelten Geninaktivierung

Die Stillegung von Genen mittels RNA ("RNA-silencing") erfolgt durch spezifische Wechselwirkung mit homologen RNA-Molekülen. Die bekannteste Form des RNA-silencing ist der post-transkriptioneller Abbau von RNA im Zytoplasma, welcher durch homologe doppelsträngige (ds) RNA induziert wird. Dieser Mechanismus wurde in Tieren "RNA-interference" (RNAi), in Pilzen "quelling" und in Pflanzen "posttranscriptional gene silencing" (PTGS) genannt. Ds RNA kann in Pflanzen auch die Methylierung homologer DNS-Sequenzen bewirken ("RNA-directed DNA methylation" oder RdDM). Unsere Arbeitsgruppe entdeckte, daß ds RNA, welche Promotorsequenzen enthält, die Methylierung und transkriptionelle Inaktivierung (TGS) homologer Promotoren in trans bewirken kann. Diese Methode der Gen-Inaktivierung ist besonders für Ansätze der funktionellen Genomik interessant, im speziellen für die gezielte Inaktivierung von einzelnen Mitgliedern einer Genfamilie mit verschiedenen Promotorelementen. Sie könnte auch eine natürliche Rolle in der Regulation von Promotoren über epigenetische Modifikation spielen. Obwohl der Mechanismus von PTGS/RNAi bereits teilweise mittels genetischer und biochemischer Methoden aufgeklärt wurde, so ist doch das Ausmaß der Überschneidung von PTGS Komponenten mit denen für RNA-gesteuertes TGS noch unbekannt. Zudem ist der Weg, in dem RNA mit der DNA-Methylierungsmaschinerie und (vielleicht) mit der Chromatinmodifizerungsmaschinerie interagiert, um epigenetische Änderungen auf Genomebene zu induzieren, noch größtenteils unerforscht. Wir schlagen einen genetischen Ansatz über die Mutagenese eines von uns in der Modellpflanze Arabidopsis etablierten "silencing" Systems vor, das über Promotor ds RNA induziert wird, um den Mechanismus für RNA-gesteuertes TGS und RdDM aufzuklären. Diese Studien können potentiell Proteine identifizieren, die RNA mit dem Prozeß der homologen DNA-Methylierung verbinden. Weiters könnte erfaßt werden, in welchem Ausmaß die Mechanismen von PTGS und RNA-gesteuertem TGS über eventuell gemeinsam benutzte Proteine überlappen.

Pflanzen und Tiere müssen um zu wachsen und um sich richtig entwickeln zu können Mechanismen besitzen, die sicherstellen, daß jeder Zelltyp nur eine bestimmte Gruppe von, -die für ihn charakteristischen - Genen exprimiert, während der Rest der Gene stillgelegt bleiben. Eine wichtige Frage ist es, wie Faktoren, die diese Stilllegung bewirken in der Erbsubstanz gezielt ihre Wirkung entfalten können. Vor Kurzem in verschiedenen Labors, darunter auch unseres, durchgeführte Arbeiten, zeigten, dass die gezielte Spezifität über kleine Ribonukleinsäure (RNA) Moleküle erfolgt, die durch Zerkleinern längerer doppelsträngiger RNA Moleküle im RNA-Interferenz Pfad erfolgt. Die kleinen RNA Moleküle können die komplementäre DNA-Sequenzen in der Erbsubstanz auffinden, wohin dann Enzyme rekrutiert werden, die chemische Modifikationen an DNA durchführen können, die mit Gen Inaktivierung verbunden sind. Unsere Arbeiten konzentrieren sich auf eine Art der Gen Inaktivierung in Pflanzen, die als RNA- vermittelte DNA Methylierung bezeichnet wird. Um Proteine zu identifiziere, die für diese Art der Gen Inaktivierung notwendig sind, führten wir eine Suche nach mutierten Pflanzen durch, die nicht mehr RNA vermittelte DNA Methylierung und damit verbundene Geninaktivierung eines Zielgens durchführen können. Da wir die Modellpflanze Arabidopsis thaliana für unsere Arbeiten verwenden, konnten wir einige neue pflanzenspezifische Proteine identifizieren, - wir nannten sie DRD, für Defekt in RNA vermittelter DNA Methylierung. Die DRD Proteine - eines davon ist ein sogenannter Chromatin umbildender Faktor, und die anderen zwei sind Untereinheiten einer ungewöhnlichen RNA polymerase, die als Pol IV bezeichnet wurden - helfen wahrscheinlich bei der Öffnung der Ziel-DNA Sequenz wenn die komplementären kleinen RNA Moleküle anwesend sind. Dies wiederum stellt die Ziel-DNA gegenüber Enzymen bloß, die als DNA Methyltransferasen bezeichnet werden. Diese können Cytosin in DNA methylieren und dadurch Gen Inaktivierung bewirken. Interessanterweise fanden wir auch, dass die DRD Protein Maschinerie auch bei der Entfernung von Cytosin Methylierung eine Rolle spielt, und zwar über einen anderen Enzymtyp, der als DNA Glycosylasen bezeichnet wird, und somit die Gen Inaktivierung wieder aufhebt und Reaktivierung der Zielgene bewirkt. Wir spekulieren, dass die Fähigkeit durch die Aktivität der DRD Proteine Zielgene in einem potentiell reversiblen Expressionszustand zu halten, helfen kann, Pflanzen die unbeweglich sind, mit unvorsehbaren Wachstumsbedingungen zurechtkommen zu lassen. Obwohl die DRD Proteine, die wir identifiziert haben pflanzenspezifisch sind, gibt es Hinweise, dass ein ähnlicher Prozess von durch kleine RNA Moleküle vermittelte Modifikation von Chromosomen auch im Tierreich, miteingeschlossen Menschen, beibehalten wurde. In der Tat wird die Durchführbarkeit einer solchen Vorgangsweise für therapeutische Zwecke in anderen Labors untersucht. Wir setzen unsere Studien mit Untersuchungen fort, wie Pflanzen die durch kleine RNA vermittelte reversible Chromosomen Modifikationen für die Adaptierung an Ihre Umgebung verwenden.