Funktionsanalyse der Glykosylierung von S-Schichten

Das Ziel des beantragten Forschungsprojekt ist eine vollständige und detaillierte Beschreibung der im S- Schichtglykan-Biosynthesecluster des thermophilen, Gram-positiven Bakteriums Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a vorliegenden Gene. Die Arbeiten umfassen die Charakterisierung der verschiedenen Glykosyltransferasen sowie der weiteren, am Aufbau des S-Schichtglykoproteinglykans beteiligten Enzyme. Zusätzlich soll zum erstenmal die Wechselwirkung zwischen der Synthese des S-Schichtproteins von G. stearothermophilus NRS 2004/3a, welches durch das von uns kürzlich identifizierte Gen sgsE codiert wird, und der durch den S-Schichtglykan-Biosynthesecluster definierten Glykosylierung bei der Proteinexpression untersucht werden. Diese Arbeiten stellen die Voraussetzung für die geplanten biomedizinischen und biotechnologischen Anwendungen des S-Schichtglykoproteins von G. stearothermophilus NRS 2004/3a dar. Zum einen soll versucht werden, durch gezielte Modifikationen, wie die Ausschaltung (Knock-out) einzelner Gene, die Glykosylierung des S-Schichtproteins zu verändern und auch die Mikroheterogenität bei der Kettenlängeverteilung der S- Schichtglykane zu beeinflussen. Durch das Einbringen des Heptose-Operons von Aneurinibacillus thermoaerophilus DSM 10155 in eine Mutante von G. stearothermophilus NRS 2004/3a, welche verkürzte Glykanketten besitzt, soll versucht werden, die sich ausbildenden Glykanstrukturen zu modifizieren. Mit der Herstellung eines derartigen Modell-S-Schichtneoglykoproteins wäre die prinzipielle Möglichkeit der Produktion von rekombinanten, potentiell medizinisch relevanten, Glykoproteinen im bakteriellen System aufgezeigt. In der Folge könnten auch andere medizinisch bedeutsame Zuckerrezeptorstrukturen hergestellt und als S- Schichtneoglykoproteine exprimiert werden. Durch die vorgeschlagenen Untersuchungen wird die Basis für eine breite Anwendung von S- Schichtneoglykoproteinen als wichtige Zielstrukturen in Biomedizin und Nanotechnologie geschaffen. Da Bakterien relativ einfach kultivierbar sind und mit diesem System mögliche Probleme bei der Glykosylierung von Proteinen umgangen werden, bietet die Herstellung von rekombinanten, bakteriellen S-Schichtneoglykoproteinen eine interessante Alternative zur Produktion von Glykoproteinen in Zellkulturen mit eukaryotischen Zellinien.

Die Ziele des kürzlich beendeten zweijährigen Forschungsprojekts "Funktionsanalyse der Glykosylierung von S- Schichtproteinen" waren folgende: 1., eine vollständige Beschreibung der an der Glykosylierung des S- Schichtproteins des thermophilen, Gram-positiven Bakteriums Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a beteiligten Gene und Versuche zur Modifikation der im Bakterium vorliegenden natürlichen S-Schicht- Glykosylierung und 2., Entwicklung von geeigneten Methoden zur genetischen Transformation von thermophilen Bacillus-Stämmen. Diese Arbeiten stellen die Voraussetzung für die geplanten biomedizinischen und biotechnologischen Anwendungen des S-Schichtglykoproteins von G. stearothermophilus NRS 2004/3a dar. Für diesen Zweck sollte durch geeignete genetische Methoden eine gezielte Modifikationen der Glykosylierung des S-Schichtproteins dieses Stammes erreicht werden. Da keine der angewendeten Methoden in der zur Verfügung stehenden Zeit zur erfolgreichen Transformation von G. stearothermophilus NRS 2004/3a führte, wurde eine Zusammenarbeit mit Prof. Neil E. Welker, Northwestern University, Evanston, IL, U.S.A., einem Pionier im Bereich der genetischen Manipulation von thermophilen Bacillen, etabliert, die aber wegen der kurzen Projektdauer ebenfalls nicht erfolgreich war. Neben den Transformationsversuchen mit verschiedenen thermophilen Bacillus-Stämmen wurde der gesamte slg- Gen-Cluster von G. stearothermophilus NRS 2004/3a kloniert und sequenziert (GenBank AF328862). Mittels Northern Analyse und RT PCR Experimenten konnte gezeigt werden, dass das S-Schicht-Strukturgen sgsE dieses Stammes monocistronisch transkribiert wird, während die Gene des slg-Gen-Clusters polycistronisch transkribiert werden. Zusätzlich wurden die möglichen Funktionen aller Gene des Clusters durch Datenbank-Sequenzvergleiche vorausgesagt. Diese Informationen stellen eine wichtige Basis für die erfolgreiche Expression und funktionelle Charakterisierung der durch die im slg-Gen-Cluster codierten Proteine dar. Da es bisher nicht möglich ist, thermophile Bacillus-Stämme zu transformieren, werden bei zukünftigen Arbeiten andere Expressionssysteme verwendet. Erst kürzlich gelang uns die heterologe Expression von SgsE in Lactococcus lactis und wir versuchen gegenwärtig den gesamten slg-Gen-Cluster in verschiedenen heterologen Systemen zu exprimieren. Durch die vorgeschlagenen Untersuchungen wird die Basis für eine breite Anwendung von S- Schichtneoglykoproteinen als wichtige Zielstrukturen in Biomedizin und Nanotechnologie geschaffen. Da Bakterien relativ einfach kultivierbar sind und mit diesem System mögliche Probleme bei der Glykosylierung von Proteinen umgangen werden könnten, bietet die Herstellung von rekombinanten, bakteriellen S- Schichtneoglykoproteinen eine interessante Alternative zur Produktion von Glykoproteinen in Zellkulturen mit eukaryotischen Zellinien.