Struktur-Funktionsbeziehung humaner Peroxidasen

Die Peroxidase Superfamilie II umfasst die Enzyme Myeloperoxidase (MPO), Eosinophile Peroxidase (EPO), Laktoperoxidase (LPO) und Thyroidperoxidase (TPO). MPO und EPO kommen in spezialisierten weißen Blutzellen (Neutrophile bzw. Eosinophile) vor, während LPO Bestandteil vieler Sekrete (z.B. Milch oder Tränenflüssigkeit) ist. MPO, EPO und LPO spielen eine wichtige Rolle bei der unspezifischen Immunabwehr, während TPO an der Biosynthese von Schildrüsenhormonen beteiligt ist. Die herausragende biochemische Reaktion von MPO, EPO und LPO ist beispielweise die Oxidation von Halogeniden und anderen biogenen Anionen mittels Wasserstoffperoxid. Die gebildeten Reaktionsprodukte werden bei phagozytotischen Prozessen in der Abwehr von Pathogenen (Bakterien, Viren) eingesetzt. Zudem scheinen diese Enzyme auch bei entzündlichen Gewebsschädigungen bei diversen Krankheiten prominent beteiligt zu sein (z.B. bei rheumatoider Arthritis oder Arteriosklerose, Asthma ect.). Der genaue Wirkmechanismus ist jedoch ungeklärt. Myeloperoxidase, Eosinophile Peroxidase und Laktoperoxidase unterscheiden sich dramatisch in der Substratspezifität und der Reaktivität der Enzymintermediate. Trotz ihrer physiologisch so bedeutenden Rolle ist der Reaktionsmechanismus dieser Enzyme bislang nicht mit modernen biochemischen und kinetischen Methoden untersucht worden. Das vorliegende Projekt bietet nun erstmals die Möglichkeit Struktur-Funktionsbeziehungen dieser Enzyme im Detail zu studieren. Dem Einreicher ist es in den letzten Jahren gelungen, große Mengen an MPO und EPO aus dem menschlichen Blut zu isolieren und Methoden zum Studium der kurzlebigen Enzymintermediate mit Hilfe der sequentiellen Stopped-flow Technik zu etablieren. Durch Zusammenarbeit mit einer belgischen Gruppe unter Dr. N. Moguilevsky (Uinversität Brüssel), die als einzige bisher funktionsfähige rekombinante MPO durch Expression in Hamsterzellen produzieren konnte, sollen nun mit Hilfe der bekannten dreidimensionalen Struktur von MPO und der ortsspezifischen Mutagenese zahlreiche Mutanten produziert und umfangreiche kinetische Untersuchungen durchgeführt werden. Durch Vergleichsuntersuchungen an den aus dem Blut isolierten Enzymen und Modellierungsexperimenten soll dann der detailierte Reaktionsmechanismus und die physiologische Relevanz dieser außergewöhnlichen Proteine geklärt werden.

Die humanen Peroxidasen Myeloperoxidase (MPO), Eosinophile Peroxidase (EPO) und Lactoperoxidase (LPO) sind Teil der angeborenen Immunabwehr. Sie werden bei der Abwehr von pathogenen Mikroorganismen in hohen Konzentrationen freigesetzt und katalysieren Halogenierungs-, Nitrosylierungs- und Oxidationsreaktionen von Biomolekülen, wodurch Bakterien und Viren inaktiviert werden. Oftmals kommt es dabei auch zur oxidativen Schädigung körpereigener Gewebe und Entzündungen sind die Folge. MPO und EPO sind in speziellen weißen Blutzellen in hohen Konzentrationen vorhanden und ihre Plasma- bzw. Gewebskonzentration korreliert mit dem Infektions- und/oder Entzündungsgrad. Die humanen Peroxidasen werden daher mit der Pathogenese vieler Krankheiten in Zusammenhang gebracht, die in westlichen Gesellschaften eine bedeutende Rolle spielen, wie z.B. Atherosklerose oder Asthma. Ziel dieses Projektes war die Aufklärung von Struktur-Funktionsbeziehungen humaner Peroxidasen, die in späterer Folge vielleicht die Basis einer medikamentösen Intervention darstellen können. Im aktuellen Projekt wurden daher die spektroskopischen und kinetischen Eigenschaften humaner Peroxidasen und ausgewählter Mutanten charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe Reduktionspotentiale sehr kurzlebiger Enzymintermediate bestimmt werden können. Erstmals wurde der Mechanismus der Katalaseaktivität humaner Peroxidasen aufgeklärt. Mit Hilfe von ortsspezifischer Mutagenese konnte die Rolle der für humane Peroxidasen typischen Protein- Hämverknüpfungen in der enzymatischen Katalyse dieser Oxidoreductasen aufgezeigt werden. Ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Hämverdrillung, Redox- und spektralen Eigenschaften sowie der Oxidationskapazität von Halogenen konnte aufgezeigt werden. In Myeloperoxidase ist die prosthetische Gruppe über drei kovalente Bindungen mit dem Protein verknüpft. Die MPO-typische Sulfonium-Verknüfung mittels einem konservierten Methionin (Met243) verleiht diesem Enzym die einzigartige Kapazität Chlorid zu oxidieren. Wird Met243 ausgetauscht kann das Protein nicht mehr Chlorid in Hypochlorit umwandeln und verliert dadurch seine physiologische Funktion. Das benachbarte Glutamat (Glu242) hingegen bindet das Häm über eine Esterbindung und ist wichtig für die Bindung sämtlicher Halogene, sodass Glu242 Mutanten generell Halogenide langsamer oxidieren.