Stabilisierung der Pyranose-Oxidase aus T. multicolor

Das pilzliche Flavoenzym Pyranose-Oxidase (P2O) oxidiert eine Reihe von unterschiedlichen Zuckern an der Position C-2, während Elektronen auf Sauerstoff übertragen werden und Wasserstoffperoxid erhalten wird. P2O ist von beträchtlichem biokatalytischem Interesse, etwa für die Produktion von z.B. probiotischen Lebensmittelzusatzstoffen wie Tagatose, welche die Gesundheit und das Wohlbefinden der Konsumenten positiv beeinflussen können, oder auch für die Synthese von Substanzen von pharmazeutischem Interesse, welche als mögliche Angriffspunkte bei der Chemotherapie von Malaria gesehen werden. Ein Nachteil beim Einsatz von P2O ist allerdings die geringe Stabilität dieses Biokatalysators unter Prozeßbedingungen. Erste Studien haben gezeigt, daß ein möglicher Grund dieser geringen Prozeßstabilität die chemische Modifizierung des Enzyms während des Substratumsatzes ist. Es ist daher das Ziel dieses Projektes, die Stabilität der Pyranose-Oxidase aus dem Weißfäulepilz Trametes multicolor für den biokatalytischen Einsatz zu verbessern. Hierzu werden zwei unterschiedliche Ansätze gewählt. Beim ersten Ansatz sollen Aminosäuren des Enzyms, die während des Substratumsatzes modifiziert werden (z.B. durch Oxidation durch das entstehende Wasserstoffperoxid), durch Verwendung von modernen massenspektrometrische Methoden identifiziert und anschließend durch Punktmutation der betroffenen Aminosäure geändert werden. Die so erhaltenen Enzyme werden charakterisiert und mit dem Wildtyp-Enzym verglichen, im speziellen in Bezug auf die Stabilität unter Prozeßbedingungen. Der zweite mögliche Ansatz zur Verbesserung der Stabilität sieht die Verwendung von alternativen Elektronenakzeptoren (etwa unterschiedlich substituierte Benzochinone oder komplexierte Metallionen) an Stelle von Sauerstoff vor, wodurch die Bildung des reaktiven Wasserstoffperoxids vermieden wird. Um diese Elektronenakzeptoren jedoch in sehr geringen stöchiometrischen Konzentrationen einsetzen zu können ist eine spezielle Reaktionstechnik notwendig, bei der ein zweites, regeneratives Enzym zur kontinuierlichen Bereitstellung des Elektronenakzeptors verwendet wird. Diese Reaktionstechnik sollte auch für andere biotechnologisch interessante Flavoproteine verwendbar sein. Weiters ist in Zusammenarbeit mit einem schwedischen Partner die Aufklärung der Kristallstruktur der P2O aus T. multicolor vorgesehen.

Pyranose-Oxidase (P2O) ist ein Enzym des Lignozellulose-Stoffwechsels, das in höheren Pilzen häufig gefunden wird. Bislang wurden eine Reihe von wichtigen Anwendungen für P2O beschrieben, das Enzym wird etwa in der medizinischen Analytik zum Nachweis einer Markerverbindung von Diabetes mellitus eingesetzt. Weiters ist es in der industriellen Biotechnologie von Interesse, wo es als Biokatalysator für die spezifische Oxidation von verschiedenen Zuckern verwendet wird. Einige dieser oxidierten Verbindungen sind interessante Zwischenstufen für anschließende Reaktionen. Ein Beispiel hierfür ist etwa die P2O-katalysierte Oxidation von Galaktose (einem Bestandteil des Milchzuckers Laktose). Galaktose kann spezifisch zur 2-Keto-Galaktose oxidert werden, diese wiederum kann in Tagatose umgesetzt werden. Tagatose ist gerade für den Bereich der Lebensmitteltechnologie von Interesse. Dieser Zucker kommt natürlich vor (er wird in geringen Mengen in einigen Beeren gefunden), ist ähnlich süß wie Kristallzucker (Saccharose), hat aber deutlich weniger Kalorien, ruft kein Karies hervor und zeigt einen präbiotischen Effekt, d.h. er stimuliert das Wachstum von erwünschten positiven Darmkeimen wie Bifidobakterien. Pyranose-Oxidase ist in technologischen Anwendungen allerdings nicht besonders stabil und inaktiviert rasch. Der Grund hierfür ist die Bildung von reaktivem Wasserstoffperoxid als zweitem Reaktionsprodukt. Das Ziel dieses Projektes war es, die Inaktivierung besser zu verstehen und das Enzym während seines technologischen Einsatzes zu stabilisieren. Im Zuge dieser Arbeiten konnten wir eine Aminosäure identifizieren, die durch Wasserstoffperoxid oxidiert wird. Allerdings spiel diese Aminosäure offensichtlich auch im Reaktionsmechanismus eine wichtige Rolle, sodass deren Austausch zur Stabilisierung nicht möglich war. In weiteren Untersuchungen wurde eine spezielle Reaktiosntechnik entwickelt, bei der kein Peroxid gebildet wird; dies wurde durch Verwendung von alternativen Elektronenakzeptoren statt Sauerstoff erreicht. Damit konnte die P2O im Prozess um den Faktor 5 stabilisert werden. Weiters wurde ein neues Enzym, Pyranose-Dehydrogenase, im Detail beschrieben. Dieses Enzym ist durch eine noch breitere Substratspezifität als die P2O charakterisiert, es kann neben der Bildung von Tagatose auch für die Bildung von Lactulose eingesetzt werden. Lactulose ist ebenfalls präbiotisch, wird aber auch im pharmazeutischen Bereich verwendet. Sowohl Pyranose-Oxidase als auch Pyranose-Dehydrogenase sind für die Anwendung in Brennstoffzellen interessant. Wir konnten in diesem Projekt zeigen, dass beide Enzym bei Verwendung von geeigneten Redoxpolymeren Elektronen auf Elektroden übertragen können. Diese Brennstoffzellen werden als unabhängige Energiequellen, etwa aus Zucker und Sauerstoff, untersucht.