Konformationen dehydratisierter/teilhydratisierter Proteine

Wasser ist von zentraler Bedeutung für die biologische Aktivität von Proteinen. Erst durch die komplexe Wechselwirkung zwischen Wassermolekülen und einem Protein wird dessen jeweilige "native", also biologisch aktive, dreidimensionale Struktur stabilisiert. Viele Proteine sind nur in Verbindung mit Kofaktoren (wie zum Beispiel dem Häm) biologisch aktiv. Auch in diesem Fall bewirken Wassermoleküle, dass der aus Protein und Kofaktor bestehende Komplex eine stabile, biologisch aktive Gesamtstruktur annimmt. Häufig finden sich sogar strukturbildende Wassermoleküle an der Grenzfläche zwischen Protein und Kofaktor; sie können daher als integrale Bestandteile des aktiven Komplexes betrachtet werden. Proteine können erst nach Abschluss ihrer Biosynthese am Ribosom ihre funktionelle Struktur ausbilden. Für diesen Prozess, die Proteinfaltung, spielt Wasser ebenfalls eine essentielle und bisher nicht ausreichend verstandene Rolle. Der Bedeutung von Wasser für die Funktion von Proteinen wird in jüngster Zeit zunehmend Beachtung geschenkt, und Proteine in der kondensierten Phase werden immer häufiger mittels NMR-Spektroskopie und Röntgenkristallstrukturanalyse unter dem Aspekt der Hydratation studiert. Ein grundsätzlich anderer und neuer experimenteller Ansatz, mit dem im Gegensatz zu den oben genannten Methoden auch komplett desolvatisierte und partiell hydratisierte Proteine untersucht werden können, soll in diesem Projekt realisiert werden. Dabei werden die Proteine in einem Sprühprozess zunächst vom Grossteil des Lösungsmittels befreit, anschliessend werden die verbliebenen Wassermoleküle kontrolliert verdampft. Zurück bleiben, je nach gewählten experimentellen Bedingungen, komplett desolvatisierte oder partiell hydratisierte Proteine, die in einem speziellen Massenspektrometer mit Ionenspeicher-Eigenschaften studiert werden können. Eine neue massenspektrometrische Technik, die Elektronen-Einfang Dissoziation (Electron Capture Dissociation, ECD), ermöglicht dann die Lokalisierung der Wassermoleküle in den partiell hydratisierten Proteinen. Ausserdem geben die mittels ECD erhaltenen Strukturinformationen Auskunft darüber, wie sich die Proteinstruktur durch Hydratation ändert, und es können sogar Energien von Faltungsprozessen desolvatisierter Proteine bestimmt werden. Das Ziel dieses Projekt ist, experimentelle Antworten auf einige derzeit kontrovers diskutierte Fragen zu geben: Wie sehr gleichen sich die Strukturen von vollständig gelösten und komplett desolvatisierten Proteinen? Auf welche Weise beeinflusst die Hydratation die Struktur eines Proteins? Was ist der Effekt der Hydratation auf die Proteinfaltung? Neben ihrer grundlegenden Relevanz für biochemische Prozesse werden die Resultate dieses Projekts von grosser Bedeutung für die biochemische Analytik mittels moderner massenspektrometrischer Verfahren sein, und sie stellen einen Verknüpfungspunkt mit Protein-Modellrechnungen dar.

Das Ziel des Projektes P15767 war, die Konformationen gasförmiger Proteinionen und die Auswirkung der Hydratation auf die Proteinkonformation und den Faltungsprozess besser zu verstehen. Die gasförmigen Proteinkonformere, die sich nach der Desolvatation im thermischen Gleichgewicht ausbilden, wurden mit "electron capture dissociation" (ECD) in einem Fourier Transform - Ionen Cyclotron Resonanz (FT-ICR) Massenspektrometer studiert. Aus kombinierten ECD, H/D-Austausch und Infrarot-Photodissoziation Spectroskopie (IRPDS) Daten wurden Strukturvorschläge für die gasförmigen Ubiquitin-Ionen in unterschiedlichen Ladungszuständen, die mit Electrospray Ionisation (ESI) beobachtet werden, erarbeitet. Der Befund einer vorherrschend helikalen Sekundärstruktur in den gasförmigen 7+ Ubiquitin-Ionen aus ESI von nicht- denaturierenden Lösungen widerspricht der oft gemachten Annahme dass native Proteinstrukturen (mit 43% ß- Faltblatt und nur 21% a-Helix Gehalt für Ubiquitin) in der Gasphase erhalten bleiben. Der Effekt der Hydratation auf die Proteinstruktur wurde mit "native electron capture dissociation" (NECD) studiert, welches ein im Rahmen dieses Projektes neu entdecktes Phänomen ist. NECD findet während der frühen Phase der Desolvatation des ESI-Prozesses statt, und kann zur Charakterisierung von Intermediaten in der strukturellen Reorganisation von Proteinen im Übergang zum gasförmigen Zustand verwendet werden. Ausserdem können mit NECD Aminosäure-spezifische Informationen zum Effekt der Hydratation auf die Proteinstabilität erhalten werden. Die Analyse für Cytochrom c vom Pferd zeigt, dass der erste Schritt in der konformationellen Reorganisation als Folge der Dehydratation die Separation der terminalen Helices ist, gefolgt vom Entfalten des His18-Loops (Aminosäuren 18-34), im Einklang mit einer beträchtlichen Schwächung der hydrophoben Bindungen nach Wegnahme des Wassers. Eine Analyse von Temperatur-abhängigen Daten ergab ausserdem relative Aktivierungsenergien für die Dissoziation individueller Protein/Häm Wechselwirkungen in Cytochrom c. Die Stabilitäten waren in der Reihenfolge T49 > F82 > L68 > K13, was eine grössere Stabilität der Wasserstoffbrückenbindung (T49) gegenüber hydrophoben Bindungen (F82, L68, K13) in der Gasphase widerspiegelt. Die stabilste strukturelle Region in Lösung, nämlich die gekreuzten terminalen Helices, wird zur labilsten Region in der Gasphase, und die zweitschwächste Region in Lösung mit der T49/Häm Wechselwirkung ist die stabilste Region in der Gasphase.